草地早熟禾根际磷细菌的分离与鉴定
摘要：利用选择性培养基从草地早熟禾（Poa pratensis）根际土壤中筛选到8株有机磷细菌和7株无机磷细菌，根据其形态学和生理生化等特性进行了鉴定。结果表明，有机磷细菌菌株PO1、PO3、PO4、PO5鉴定为Bacillus cereus（蜡状芽孢杆菌），菌株PO2、PO6和PO7鉴定为Bacillus megaterium（巨大芽孢杆菌），菌株PO8为Bacillus badius（栗褐芽孢杆菌），而本试验筛选到的无机磷细菌菌株均为Pseudomonas sp.（荧光假单胞菌）。
关键词：草地早熟禾；磷细菌；分离；鉴定
中图分类号： S688.406文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0314-03
收稿日期：2013-10-22
基金项目：海南省自然科学基金（编号：312060）。
作者简介：梁净（1991—），男，瑶族，主要从事草坪管理相关研究。E-mail：airstreet00@163.com。
通信作者：张晓波，博士，副教授。E-mail：angiaoo@126.com。磷是植物生长发育必需的重要营养元素，但我国目前土壤缺磷面积较大，增加土壤磷素的主要途径依然是靠草地生产中施用的磷肥。由于施入可溶性的磷肥会使农田大部分迅速转变为作物难以吸收的无效磷，最终导致作物对磷肥的当季利用率很低[1-2]。对于我国而言，提取固定土壤中释放的无效磷，对提高土壤可利用磷素含量、减少磷肥使用具有重要的意义[2]。磷细菌是可以将土壤中有机磷和难溶性无机磷转化为可溶性无机磷的细菌，可分为解磷菌（有机磷细菌）和溶磷菌（无机磷细菌）两大类[3-5]。研究证明，土壤中存在大量微生物，能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态[6]，对于将无效磷转变为有效磷有着至关重要的作用。
草地早熟禾（Poa pratensis）是常用的冷季型草坪草，其绿期长、适应性强、分布广，抗霜冻及耐寒能力强，对于北方城市草坪美化、绿化有重要意义。肥料的合理施用对其生长及发挥生态效益具有重要作用，其中磷肥对草坪草的重要作用主要表现在抗性方面[7-9]。我国目前磷矿资源贫乏，生产能力低，使用的磷肥主要依靠外国进口，因此，研发生物磷肥，既可提高作物产量，又可保护土壤资源，对于农业生产可持续发展有着重要意义。根据生态学原理，特定种类的有益菌株，从原习居地取样筛选，不仅能满足植物的专一性，且能获得较高成功率。本研究利用选择培养基，从草地早熟禾根际土壤样品中对磷细菌进行分离、纯化、鉴定，对于有效利用磷细菌菌株及调控植物根系微生物系统有重要意义，可为研制专用生物磷肥提供必要实践及理论基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试土样基本特征草地早熟禾根际磷细菌土样取自山西农业大学校园内年限为3年的健康草地早熟禾根际土壤，其pH值为8.24，有机质含量为8.59 g/kg，全钾为 3.18 g/kg，全磷为0.21 g/kg，全氮为0.17 g/kg，速效钾为90.67 mg/kg，速效磷为60.37 mg/kg。
1.1.2培养基蒙金娜有机培养基[10-11]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 1.0 g，酵母粉 0.5 g，琼脂20 g，总体积1 000 mL（蒸馏水补足），pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。
Pikovaskaias（PKO）无机培养基[10-11]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.036 g，Ca3（PO4）2 2.0 g，琼脂20 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，总体积1 000 mL（蒸馏水补足），pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。
Luria-Bertani（LB）培养基[12]：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，琼脂20 g，总体积 1 000 mL（蒸馏水补足），pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。
土壤矿物：去除有机残体的土壤，取土样3 g，加入20% HCl 30 mL，煮沸30 min，过滤，用蒸溜水淋洗至无氯离子反应。
1.2方法
1.2.1根际土壤的采集采样区为山西农业大学校园内健康的草地早熟禾草坪，取草坪区域良好处作为标准样地（3 m×3 m），在每个标准样地内按“S”形随机选择5株草地早熟禾植株，先除去其表层的枯草及落叶，随后将整个植株带根系慢慢挖出，轻轻抖落根系上的大块土壤，收集附于植株根系表面约2 mm左右的土壤，分别将采集到的根际土样装入经过高压消毒的无菌纸袋，并在袋上注明采集日期以及土样号，带回实验室立即进行试验。
1.2.2磷细菌分离称取各根际土壤样品1 g，在无菌条件下操作，分别取9 mL无菌水和8粒无菌玻璃珠装入 250 mL 的三角瓶中，置于恒温振荡机上25 ℃ 、170 r/min振荡 20 min，得到10-1稀释度的土壤悬液。用无菌吸管分别吸取10-1稀释度的土壤悬液1 mL并注入装有9 mL无菌水的三角瓶中作10-2稀释度的土壤悬液，随后再用无菌吸管吸取10-2稀释度的土壤悬液1 mL并注入装有9 mL无菌水的试管中作10-3稀释度的土壤悬液，依此类推，分别得到10-4、10-5、10-6稀释度的各土样悬液。用移液管吸取上述稀释度为10-4、10-5、10-6的各土壤悬液，每个稀释度设3个重复。稀释平板法，有机磷细菌菌株于28 ℃下培养 24 h，无机磷细菌菌株在28 ℃下培养2～4 d，分别观察其菌落形态。由于有机磷细菌能分解卵黄中的有机磷产生磷酸，无机磷细菌能分解磷酸钙盐产生有机酸或无机酸，使难溶性的磷酸钙盐转化为可溶性磷酸盐，所以在其菌落的周围可形成一个透明圈。挑选周围产生透明圈的单菌落，接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基培养，在LB平板上2次活化再接入牛肉膏蛋白胨斜面保存。
1.2.3磷细菌的形态及生理生化特性鉴定（1）革兰氏染色：取用24 h菌龄的纯培养物制片染色后通过镜检观察其染色结果。（2）芽孢染色：采用淀粉铵盐培养基[13]培养 3 d，用芽孢染色法[13]观察其形状及着生位置。（3）鞭毛染色：取连续传代培养2次的菌种，接种至新鲜配制的琼脂斜面上（有冷凝水），30 ℃培养24 h，观察硝酸银染色的结果。（4）菌体大小测定：简单染色后用数码显微镜观测菌体长及宽。（5）液体培养特征：将供试菌株接种在硅酸盐细菌液体培养基中，置于30 ℃恒温下培养6 d，观察是否形成菌环、菌膜、浑浊或沉淀特征。（6）菌落特征：用接种环接菌，对制成的平板进行划线，置于30 ℃恒温下培养5～6 d，观察并且描述其菌落大小、颜色、形状、是否黏稠、是否透明。（7） 过氧化氢酶试验：将供试菌株活化后（培养18～24 h），有机磷细菌菌株接种于蒙金娜有机培养基斜面上，无机磷细菌菌株接种于PKO无机培养基斜面上，分别置于30 ℃下培养，7 d 后，在丰满的菌苔上滴加3% H2O2 1 mL，立即检查其结果，5 min 内如出现气泡则为阳性反应，记录为“+”，否则为“ -”。（8） 其他生化性状：甲基乙酰甲醇试验（V.P试验）、酪素水解、淀粉水解、产吲跺试验、卵磷脂酶、硝酸盐还原试验等均按常用方法[14]进行。
2结果与分析
2.1菌株的分离
用接种环取上述分离到的各类菌株的纯培养物，再以平板划线法将其分别接种于平板培养基上，置于28 ℃的培养箱中培养24～48 h。视菌落生长情况，在蒙金娜有机培养基挑出8株有机磷细菌菌落，分别编号为PO1至PO8。在PKO培养基挑出7株无机磷细菌菌落，分别编号为PM1至PM7。然后对挑出的菌株进一步分离纯化后，对菌株的形态和生理生化特征进行鉴定。
2.2菌株的培养特征
将分离纯化得到的8株有机磷菌株和7株无机磷菌株，分别接种在分离培养基平板上30 ℃条件下培养48 h，发现有机磷菌株（表1）在蒙金娜有机培养基上菌落形状不一，主要呈现乳白色或浅黄色，像半粒玻璃珠平贴于平板上；菌落凸起呈圆形或不规则，边缘完整或锯齿状，表面光滑，湿润有光泽，黏稠，富有弹性。无机磷菌株（表2）在PKO培养基上形状为圆形，呈现色泽不一，边缘完整或锯齿状，表面光滑，湿润有光泽，黏稠，富有弹性。在液体培养条件下，分离的菌株能在培养液底部形成透明度不一的雾状沉淀，沉淀胶结成团，不易摇散，培养液浑浊度不一。表1草地早熟禾根际有机磷细菌在蒙金娜有机培养基上的菌落形态
菌株号形状隆起度透明度边缘颜色表面状况生长速度PO1不规则凸起不透明锯齿状浅黄色较湿润较慢PO2圆形凸起不透明完整白色湿润较慢PO3不规则凸起不透明完整乳白很湿润较快PO4不规则平坦不透明波浪状浅黄色很湿润较慢PO5不规则凸起稍透明完整乳白较湿润较快PO6圆形平坦不透明波浪状乳白较湿润较快PO7圆形平坦不透明完整白色湿润较慢PO8圆形凸起不透明锯齿状灰白色很湿润较快
菌株号形状隆起度透明度边缘颜色表面状况生长速度PM1圆形凸起不透明锯齿状乳白很湿润较快PM2圆形平坦不透明锯齿状灰白色很湿润较慢PM3圆形凸起透明完整乳白很湿润较快PM4圆形平坦不透明完整浅黄色很湿润较慢PM5圆形凸起稍透明完整乳白较干燥较快PM6圆形平坦透明齿状无色较干燥较快PM7圆形平坦透明完整无色很湿润较慢
2.3菌株的形态
2.4菌株的生理生化特征
2.5磷细菌的鉴定
3结论
目前微生物肥料的应用与开发尚有许多不足，但此方面的研究对启动土壤磷库资源、减少化肥的投入及环保等诸多方面具有深远的意义。本研究通过对8株有机磷菌株和7株无机磷菌株的细胞形态及生理生化特征的初步考察，对照《常见细菌系统鉴定手册》[14]及有关文献报道[17- 19]，可以确定8株有机磷细菌中的PO1、PO3、PO4、PO5为Bacillus cereus（蜡状芽孢杆菌），PO2、PO6和PO7为Bacillus megaterium（巨大芽孢杆菌），PO8为Bacillus badius（栗褐芽孢杆菌），而7株无机磷菌株均为Pseudomonas sp.（荧光假单胞菌）。分析结果表明有机磷细菌菌株为芽孢杆菌属，无机磷细菌为假单胞菌属。通过此次研究可知山西农业大学校园内草地早熟禾根系常见的磷细菌种类，为将来更好地挖掘草地早熟禾微生物的解磷潜能，对开发高效微生物肥料，提高土壤中有效磷的含量、减少化学肥料的使用、改善土壤环境方面具有积极作用，对探索草地早熟禾根际土壤的潜在肥力、发展草地早熟禾土壤地可持续农业具有一定的理论与实际作用。关于各磷细菌菌株的解磷机制和在土壤中的活动规律有待于进一步研究。
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