一株溶藻细菌的分离\鉴定及溶藻特性研究

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.001

摘 要：从三亚市大东海分离出1株有较强溶藻活性的细菌，命名为L-D1，并对该菌株进行形态和生理生化鉴定。L-D1的菌悬液对中肋骨条藻的生长有很强的抑制作用。试验发现，L-D1是通过直接和间接的方式共同作用影响中肋骨条藻的生长的；L-D1的溶藻效果在温度为25 ℃时优于其他温度，盐度为20‰时优于其他盐度，全黑暗条件下的溶藻效果优于其他光照条件下的。

关键词：溶藻细菌；中肋骨条藻；溶藻；赤潮

随着水体富营养化的不断加剧，海洋开发活动的日益增加，世界航运的不断发达，以及沿海工业、农业、海洋养殖业以及旅游业的快速发展，导致赤潮发生的频率增高、范围扩大，已经成为一种全球性的海洋灾害[1]。引发赤潮的生物有很多种，其中海洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物。在四千多种海洋浮游微藻中有260多种能形成赤潮，其中有70种产生毒素[2]。溶藻细菌可以通过直接或间接的方式，抑制藻类生长或杀死藻类，而且具有经济、安全、特异、特效、维持水体生态平衡等特点[3]。本研究通过对固体平板溶藻方法的改良，从三亚大东海分离出一株对中肋骨条藻具有溶藻效果的细菌，命名为L-D1，同时针对L-D1溶藻的特性，溶藻的方式以及环境因子对其溶藻效果的影响进行研究。

1 材料

1.1 藻种来源及培养

研究所用中肋骨条藻（Skeletonema costatum）为本实验室分离保存。藻种经活化后，在25 ℃，光照强度为3 000 lx及光暗比为12 h∶12 h条件下培养。

液体培养基配方[4]如下：NaNO3 75 mg，NaH2PO4•H2O 5 mg，Na2SiO3•9H2O 20 mg，Na2EDTA 4.36 mg，FeCl3•6H2O 3.16 mg，CuSO4•5H2O 0.01 mg，ZnSO4•7H2O 0.023 mg，CoCl2•6H2O 0.012 mg，MnCl2•4H2O 0.18 mg，Na2MoO4•2H2O 0.07 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B12 0.5 mg，生物素 0.5 mg，陈海水 1 L。

固体培养配方如下：1 000 mL 上述液体培养基中加入10～15 g琼脂。

1.2 细菌培养基

细菌固体培养基：蛋白胨10 g，肉浸粉 3 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，1 000 mL 蒸馏水。

细菌液体培养基：蛋白胨 10 g，牛肉粉 3 g，NaCl 5 g，1 000 mL 蒸馏水。

1.3 样品采集

2012年于海南省三亚市大东海采集海水用于溶藻细菌的分离。所采集样品在低温下保存并在4 h内送回实验室进行分离。

2 方法

2.1 溶藻细菌的分离

将采集的海水水样用无菌陈海水进行梯度稀释后，采用涂布法获得细菌单菌落。然后进行溶藻细菌的筛选，把冷却至45 ℃以下含有中肋骨条藻的固体培养基快速摇匀倒平板，待培养基凝固后，用无菌打孔器将从海水中分离得到的细菌单菌落打下，并倒置在中肋骨条藻平板上，在26 ℃，光照强度为3 000 lx下培养，以无菌的营养琼脂块作为对照，每天观察细菌单菌落周围是否出现抑藻圈。

将产生抑藻圈的琼脂块取下，采用平板划线法进行该菌的纯化，并观察记录菌落形态特征。将纯化的菌株接种于试管斜面培养基上，培养48 h后置4 ℃冰箱保存备用。

2.2 溶藻细菌的鉴定

对分离出的菌株进行革兰氏染色、氧化酶，接触酶，葡萄糖、甘露醇发酵，硝酸盐还原，MR-VP，7.5% NaCl培养液等生理生化鉴定，其方法参照文献[5]。

2.3 溶藻细菌在液体培养基中的溶藻效果

在液体培养基中将L-D1培养48 h后，加入到藻液中，进行液体溶藻试验。按照1∶9的比例将菌液加入到中肋骨条藻藻液中，连续7 d观察藻液变化情况。

2.4 溶藻细菌溶藻方式的探讨

按照1∶9的比例在中肋骨条藻藻液中加入以下细菌培养物：细菌原液、高温高压处理后的菌液、高速离心沉降后的菌液、0.22 μm膜过滤后的菌液，同时设对照组。7 d后，分别测试它们对中肋骨条藻叶绿素a含量的影响。

2.5 环境因子对其溶藻效果的影响

光照是藻类生长繁殖的重要生态因子，本研究选择了全黑暗、光循环、全光照三个光照条件，以探讨光照对L-D1溶藻效果的影响。每天定时取样，以叶绿素a含量变化为检测指标。

温度是影响生物体生长的重要环境因子，本实验设置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，5个温度梯度进行溶藻实验，以研究温度对溶藻细菌L-D1的影响。

盐度是水生生物生存的限制因子，本研究分别以盐度为15‰、20‰、25‰、30‰、35‰，5种不同盐度的培养液进行细菌溶藻实验。

3 结果与分析

3.1 溶藻细菌的筛选

在中肋骨条藻平板中（如图1），带有细菌菌落的琼脂块（b）周围出现了直径约为20 mm的抑藻圈，而对照琼脂块（a）周围的藻生长正常。

3.2 溶藻细菌生理生化鉴定结果

菌株L-D1为革兰氏阳性菌，菌落呈圆形、乳白色半透明、表面光滑，在液体培养基里呈直杆状，具芽孢，可运动带鞭毛。氧化酶阴性，接触酶阳性，发酵葡萄糖只产酸不产气，可利用甘露醇产酸，可还原硝酸盐，MR阳性，VP阴性，在7.5%的NaCl中不能生长。

a为无菌琼脂块作对照，b为带菌落的琼脂块产生的抑藻圈

图1 溶藻细菌在固体培养基中对中肋骨

条藻的溶藻效果

3.3 溶藻细菌在液体培养基中对中肋骨条藻生长的影响

培养7 d后，与对照组相比，加入溶藻细菌的中肋骨条藻藻液出现大量土黄色絮凝状沉淀（如图2），显微镜观察大量藻细胞凝聚集成团状，且藻细胞周围聚集了大量的细菌，只有极少数的藻细胞单个独立存在。因此，溶藻细菌在液体培养基中也能抑制中肋骨条藻的生长。

图2 添加菌悬液7d后，中肋骨条藻液照片

3.4 溶藻细菌的溶藻方式

溶藻细菌菌液经高温处理、高速离心沉降、0.22 μm滤膜过滤后，加入到中肋骨条藻的藻液中进行共同培养，均可显著抑制其叶绿素a的含量（P＜0.05），其中细菌原液对中肋骨条藻叶绿素a的合成抑制作用最强，其叶绿素a含量比对照组减少了73.80% ，表明菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a含量的影响是通过直接和间接方式共同作用的。经高温处理后的菌液对叶绿素a的含量仍有较强的抑制作用，表明菌株L-D1分泌的代谢物为非蛋白类物质，如图3所示。

D1菌原液组，D2高温灭菌组，D3离心沉降组，D4滤膜过滤组

图3 经不同方式处理后的菌液对中肋骨条

藻叶绿素a含量的影响

3.5 环境因子对其溶藻效果的影响

3.5.1 光照对细菌溶藻效果的影响 三个光照条件下，菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a的含量影响显著（P＜0.05）。6 d后，全黑暗条件下藻的叶绿素a含量最少，为0.019 mg/L，与其相应的对照组比减少了67.74%；全光照条件下藻的叶绿素a含量最多，为0.064 mg/L。如图4所示，Duncan多重比较结果表明，全黑暗条件下溶藻细菌对中肋骨条藻生长的抑制效果最好。

图4 6 d后，不同光照条件下溶藻细菌对中肋骨

条藻叶绿素a含量的影响

3.5.2 温度对细菌溶藻效果的影响 不同温度条件下，菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a的含量影响显著（P＜0.05）。25 ℃时中肋骨条藻叶绿素a的含量为0.049 mg/L，与30、35 ℃时相比叶绿素a的含量分别减少了75.62%、85.92%。如图5所示，通过Duncan多重比较，表明溶藻细菌在25 ℃下对中肋骨条藻生长的抑制效果最好。

图5 6 d后，不同温度条件下溶藻细菌对中肋骨条

藻叶绿素a含量的影响

3.5.3 盐度对细菌溶藻效果的影响 不同盐度条件下，菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a的含量影响显著（P＜0.05）。盐度为20‰时中肋骨条藻叶绿素a的含量为0.119 mg/L，与盐度为15‰、30‰、35‰时相比叶绿素a的含量分别减少了24.7%、30.41%、36.02%。如图6所示，溶藻细菌在盐度为20‰时对中肋骨条藻生长的抑制效果最好。

图6 6 d后，不同盐度条件下溶藻细菌对中肋骨条

藻叶绿素a含量的影响

4 讨论

作为防治赤潮的一种可能性生物，溶藻细菌的研究不但具有重要的理论价值还具有潜在的应用价值。国内外对于溶藻细菌的分离有多种途径，裴海燕等[6] 利用海绵固定化微生物系统分离出了对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及栅藻（Scenedesmus sp.）具有较强溶解效果的细菌菌株。曹宾霞等[7]用试管法筛选对塔玛亚历山大藻具有溶藻能力的细菌。这两种方法的工作量都较大。王海玉等[8]分离出一株红色溶藻细菌对铜绿微囊藻有很强的溶解效果，该方法采用了果胶分解菌的培养基，所以对溶藻细菌的生存环境具有一定限制，在实际应用中存在局限。本实验通过对固体平板溶藻法的改良，首先通过涂布法获得不同细菌的单菌落，然后利用这些单菌落进行固体培养基溶藻试验，选择产生抑藻圈的菌株进行液体培养基溶藻试验，进一步验证其溶藻的效果。该方法分离周期短且操作简单，是一种分离筛选溶藻细菌的有效途径。

溶藻细菌主要通过以下方式实现溶藻效果：一是与藻细胞竞争营养物质；二是分泌胞外物质如蛋白质、抗生素等作用于藻细胞，导致藻细胞死亡；三是寄生于藻细胞内进行增殖，从而使得藻细胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分离筛选得到的溶藻细菌属于间接性溶藻，只有少部分属于直接性溶藻[10]。为了探讨菌株L-D1对中肋骨条藻的溶解方式，将不同方式处理的菌悬液按照一定比例加入到中肋骨条藻液体培养基中，均能抑制藻细胞的生长，其中菌原液对藻细胞的抑制作用最强，经滤膜过滤的菌液和经离心沉降的菌液对藻细胞有一定的抑制作用，而经高温处理后的菌液仍有较强的溶藻活性，说明细菌分泌物具有很强的溶藻效果，且热稳定性较高。结果表明菌株L-D1的作用方式以间接溶藻为主，同时进行直接溶藻。

光照主要通过光合作用影响藻细胞的生长，而对细菌的影响不大。很多研究表明在无光照的条件下，藻细胞的光合作用几乎无法进行，此时藻细胞很容易受到溶藻细菌的攻击而死亡[11]。本研究得出的结论与其它研究一致，即全黑条件下菌株L-D1对中肋骨条藻生长的抑制效果最强。在光循环条件、全光条件下菌株L-D1的溶藻效果依次减弱。在全黑暗条件下，中肋骨条藻的光合作用无法进行，而菌株L-D1的增殖却不受影响。随着培养时间的增加，溶藻细菌的数量逐渐超过藻细胞的数量呈现出较强的溶藻效果。而在全光照条件下，中肋骨条藻由于光适应周期较长，所以藻细胞可以持续生长。其增长速度不断提高，而细菌增长速度基本不变，所以藻细胞数量呈现增长趋势。

如果某一温度有利于溶藻细菌的生长，而对藻细胞的生长影响很小或者具有一定抑制作用，那么将呈现出明显的溶菌效果，反之，呈现出弱的溶藻效果或无溶藻效果[12]。由于中肋骨条藻为广温的典型代表，其在温度较高时仍能保持很高的生长率。温度在30～35 ℃时藻细胞的生长率超过菌株L-D1的，呈现出较弱的溶藻效果；而温度在20～25 ℃时菌株L-D1的生长率超过藻细胞的，则呈现出较强的溶藻效果。

微藻和细菌都有最适生长盐度，当低于或高于该盐度时，对其生长都会产生影响[13]。中肋骨条藻作为广盐的典型代表，盐度的变化对其生长的影响并不明显，而对菌株L-D1的影响则比较大。在盐度为20‰～25‰时，其比较适宜菌株L-D1的生长，故溶藻效果比较明显。而盐度为15‰、35‰时，其不适宜菌株L-D1的生长，故溶藻效果较弱。

参考文献：

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[13] 易齐涛.海洋菌-藻关系及对营养盐的吸收作用研究[D].青岛:中国海洋大学硕士学位论文，2006Isolation ，Identification and Characterization of one algae-lysing bacteria

ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）

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