水稻OsVDAC4诱饵蛋白载体的构建及鉴定
报告基因的表达，酵母可以在四缺培养基SD-Trp-Leu-His-Ade（SD-4）上生长，GUS染色为蓝色。该试验将5组质粒DNA分别共转入酵母细胞，阳性对照组（pAI-AIg5-N-NubI+pCCW-AIg5-C-Cub）在SD-Trp-Leu（SD-2）平板上长出白色菌落，在四缺培养基SD-Trp-Leu-His-Ade平板上稀释了10-4后也长出菌落（图5A），说明阳性对照组间的互作明显高于试验组和阴性对照组。试验组pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-OsVDAC4-N-Cub（第2组）和pAI-AIg5-N-NubI+pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub（第3组）在SD-Trp-Leu培养基上都有生长，在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上也有生长，但第3组在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上的长势优于第2组。在SD-Trp-Leu平板上第2组长出的菌落是白色的，而第3组长出的菌落是粉红色的，根据DUALmembranestarterkitsUserManual上的说明，当2个蛋白之间相互作用弱时，
酵母体内的腺嘌呤合成途径受阻，会有红色代谢物积累，因
此酵母会呈现出粉红色，而第3组在SD-Trp-Leu-His-Ade平板上呈现出白色菌落，且生长状态良好，SD-Trp-Leu培养
基中要比SD-Trp-Leu-His-Ade培养基中多加了Ade和His这2种氨基酸，由此推测在SD-Trp-Leu培养基上酵母呈现出粉红色可能是由于培养基中的Ade足够酵母生长所需，不需要自身合成，于是酵母呈现粉红色。但阴性对照组pBT3-OsVDAC4-N-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第4组）和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub+pDL2-AIg5-N-NubG（第5组）在SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade平板上均有生长，第5组的长势较弱（图5A）。进一步检测LacZ的活性，发现阴性对照组也能染为蓝色（图5B）。这些结果说明pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub都可以用于筛选膜酵母双杂交文库，但可能具有较高的本底反应。
为了降低本底反应，进行3-AT的严谨性优化。将文库空载pPR3-N分别转化至含有诱饵蛋白载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的酵母菌株中。pPR3-N上带有突变的NubG，诱饵蛋白载体pBT3-SUC-OsVDAC4上带有Cub，为了减少假阳性，消除本底反应，在用3-AT来减少假阳性的同时也使蛋白互作相对较弱的菌能够生长，设置了4个浓度梯度，分别是0、1.0、2.5、5.0mmol/L，重复3次试验，结果表明在不加3-AT的条件下文库空载pPR3-N与诱饵蛋白载体pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub没有发生本底反应（图6），而文库空载pPR3-N与诱饵蛋白载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub在试验所用的3-AT浓度范围内本底反应很强，随后加大3-AT浓度，到80mmol/L还是有很强的本底反应。这些结果说明诱饵蛋白载体pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub可以用于膜酵母双杂交文库的筛选。
3讨论
生物技术国家民委重点实验室植物遗传与发育课题组之前在日本晴中鉴定出了8个VDAC基因，即OsVDAC1～8。利用生物信息学方法对OsVDAC1～8进行了结构分析，并通过RT-PCR技术分析了OsVDAC1～8的表达模式，尝试构建部分OsVDACs的RNAi植株，并取得初步成功。然后对OsVDACs的原核、真核表达进行研究，并对OsVDACs进行亚细胞定位。通过膜蛋白酵母双杂交技术从YTB幼穗cDNA文库中筛选到了OsVDAC3的3个互作蛋白，成功得到了OsVDAC3超表达植株，并进一步验证了OsVDAC3与其互作蛋白间的互作。成功得到了OsVDAC5的RNAi转基因植株，并筛选得到了7个与OsVDAC5（1～75aa）互作的蛋白{9]，将其命名为OsV5IP1～7，为了探索OsVDAC5（1～75aa）与OsV5IP1～7是否真正互作，还进行了酵母双杂、pulldown、BiFC、亚细胞定位，试验结果显示它们之间发生了互作。
该试验从日本晴幼穗cDNA中扩增出OsVDAC4全长片段，连接载体pBT3-N和pBT3-SUC，得到重组载体pBT3-OsVDAC4-N-Cub和pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub。在正式筛选文库之前对2个诱饵蛋白载体进行筛选，结果表明pBT3-OsVDAC4-N-Cub的试验组和阴性对照都长势良好，相比较而言，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub的试验组长势良好的同时，阴性对照长势较弱。并且在之后的3-AT浓度筛选试验中发现，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub与文库空载几乎没有发生本底反应，而pBT3-OsVDAC4-N-Cub與文库空载发生的本底反应难以抑制，所以pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub载体更合适筛库。根据生物信息学分析，上述试验结果产生的原因可能是由于OsVDAC4的C端位于膜结构中，与之相连的Cub自由度较小，难以与没有互作的空间上较远的NubG反应，因此本底反应弱。OsVDAC4的N端Cub与没有互作的空载上的NubG具有很强的互作，说明其N端没有在膜内侧或膜中间的桶状结构中，而是位于膜外侧的细胞质中;由于其N端有约50个氨基酸残基在膜结构外面处于伸展状态，因此与它相连的Cub可以与在空间上相距很远的NubG互作，表现为很强的本底反应。综上所述，pBT3-SUC-OsVDAC4-C-Cub更适合于下一步进行互作蛋白的筛选。
参考文献
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