VASP基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定
[摘要] 目的 构建靶向血管扩张刺激磷蛋白（VASP）基因RNA干扰慢病毒表达载体。 方法 将前期构建的pcDNA6.2-miRVASP进行测序鉴定，筛选阳性克隆。通过Gateway技术中的BP反应及LR反应，将携带miRVASP的表达框克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST，构建靶向VASP基因的RNA干扰慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP；接着将其与慢病毒包装混合物共转染293FT细胞，收集病毒颗粒，侵染胃癌BGC-823细胞。 结果 慢病毒表达载体测序结果表明，构建的载体与预期完全一致。用收集的携带miRVASP表达框的慢病毒颗粒侵染BGC-823细胞，荧光显微镜下可见多量细胞表达强绿色荧光，证明包装产生的慢病毒颗粒能侵染BGC-823细胞。 结论 成功构建了靶向VASP基因的RNA干扰慢病毒表达载体，并包装产生慢病毒颗粒原液，成功侵染BGC-823细胞，为进一步在体内实验中研究VASP在胃癌侵袭转移中的作用奠定了基础。
[关键词] 血管扩张刺激磷蛋白；RNA干扰；慢病毒载体
[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0009-04
[Abstract] Objective To construct the lentiviral RNA interference expression vector targeting vasodilator-stimulated phosphoprotein （VASP） gene. Methods The pre-constructed pcDNA6.2-miRVASP was identified by DNA sequencing and the positive clones were screened. The miRVASP fragment was cloned into destination vector pLenti6/V5-DEST by Gateway techology， including BP and LR reaction， RNA interference lentiviral vector pLenti6/V5-miRVASP targeting VASP gene was constructed. Then the 293FT cells were co-transfected with the plasmid lentiviral expression vector pLenti6/V5-miRVASP and lentiviral packaging mix. The virus particles were collected and infected into gastric cancer BGC-823 cells. Results The constructed lentiviral expression vector pLenti6/V5-miRVASP was introduced into E.coli Stbl3 for amplification. DNA sequencing results showed that the constructed vector was exactly as expected. BGC-823 cells were infected with the collected lentiviral stocks carrying the miRVASP expression cassette. The results showed that a large number of cells could express strong green fluorescence， demonstrated that the packaged lentiviral stocks could infect BGC-823 cells. Conclusion The RNA interference lentiviral vector targeting VASP gene is successfully constructed and packaged as the lentiviral stocks to successfully infect BGC-823 cells， which lay the foundation for the further study of the role of VASP in gastric cancer metastasis in vivo.
[Key words] VASP； RNAi； Lentiviral vector
胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在我国，胃癌发病率居各类恶性肿瘤第二位[1]。尽管近年来胃癌病理遗传学和分子机制研究取得了许多进展，但胃癌转移仍然是癌症相关死亡的主要原因之一。肿瘤转移是一个多步骤的过程[2]，以间充质模式迁移的肿瘤细胞，首先形成由肌动蛋白丝（F-actin）网络组装驱动的细胞膜突起（伪足）；接着在原癌基因如c-Src及c-Abl激酶等分子和细胞骨架调节蛋白协调作用下，促进细胞迁移和侵袭[3]。血管扩张刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）是Ena/VASP蛋白家族成员之一[4]。其EVH2结构域介导其与球状肌动蛋白（G-actin）及F-actin的结合。最新研究表明，VASP在人肺腺癌、胃癌、乳腺癌等实体肿瘤中蛋白表达水平上调[5-8]。VASP磷酸化能抑制结肠癌细胞侵袭性伪足形成[9]。因此，我们推测VASP表达及活性可能影响肿瘤浸润进展。本研究利用前期构建的靶向VASP基因的RNA干扰真核表达载体pcDNA6.2-miRVASP及慢病毒目的载体[10]，应用Gateway重组技术中的BP反应和LR反应，构建靶向VASP基因的RNA干擾慢病毒表达载体，并包装产生慢病毒颗粒，成功侵染胃癌细胞，以期为深入研究VASP的肿瘤生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料
H-DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；左旋谷氨酰胺、LipofectamineTM2000、BP ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix、LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme、蛋白酶K、Opti-MEM培养基、pcDNA6.2-GW/EmGFP载体、pDONRTM221载体、pLenti6/V5-DEST载体、慢病毒包装混合物（Packing Mix Lentiviral）、239FT细胞株、感受态均购自lnvitrogen公司；质粒小提试剂盒购自北京天根公司；1 kb DNA Ladder购自Fermentas公司；Eag Ⅰ购自NEB公司；质粒大提试剂盒购自Axygen公司。BGC-823胃癌细胞株购自武汉大学保藏中心。靶向VASP基因的小干扰RNA真核表达载体pcDNA6.2-miRVASP由本实验室构建保存。
1.2 方法
1.2.1 慢病毒入门载体pDONRTM221-miRVASP载体的构建 PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体携带有attB位点，可与携带有attP位点的pDONRTM221载体进行BP重组反应，构建带有目的基因片段的入门克隆载体。首先将pcDNA6.2-miRVASP载体用Eag Ⅰ酶切。取等摩尔pcDNA6.2-miRVASP与pDONRTM221，加入BP ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix，25℃孵育16 h，生成入门克隆pDONRTM221-miRVASP，转化感受态，涂布于LB平板，37℃培养12～16 h，挑取单菌落，置于LB培养基中扩增，抽提质粒。
1.2.2 慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP的构建 在LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix作用下，携带有attL位点的入门克隆pDONRTM221-miRVASP和目的载体pLenti6/V5-DEST发生重组反应，生成慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP。首先取等摩尔的pDONRTM 221-miRVASP和pLenti6/V5-DEST载体，加入LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix，25℃孵育16 h，转化感受态，涂布于LB平板，培养12～16 h，挑取单菌落，于LB培养基中扩增，抽提质粒，并进行PCR鉴定，将PCR产物送测序。
1.2.3 慢病毒表达颗粒的包装与收集 培养293FT细胞。取9 μg慢病毒包装混合物和3 μg慢病毒表达载体质粒加入Opti-MEM培养基中。取36 μL LipofectamineTM2000加入Opti-MEM培养基中，室温静置5 min。将含质粒和脂质体的培养液混和，室温孵育20 min。接着加入293FT细胞，培养48～72 h，收集含病毒的细胞培养上清液，过滤分装，-80℃储存备用。
1.2.4 慢病毒表达颗粒侵染胃癌细胞株BGC-823 培养BGC-823细胞，用收集的携带miRVASP DNA表达片段的慢病毒颗粒侵染BGC-823细胞。观察细胞形态及EmGFP表达。
2 结果
2.1 靶向VASP基因的RNA干扰真核表达载体pcDNA6.2-miRVASP的鉴定
将重组质粒进行PCR鉴定及测序。测序结果表明，pcDNA6.2-miRVASP包含设计的SR33-2的DNA片段。
2.2 慢病毒入门载体pDONRTM221-miRVASP的构建
利用BP反应，成功构建携带miRVASP DNA表达片段的入门载体。质粒凝胶电泳图。见图1。
2.3 慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP的构建与鉴定
通过LR反应，将入门克隆pDONRTM221-miRVASP与目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组，得到慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP。质粒凝胶电泳图，见图2。pLenti6/V5-DEST 质粒全长8688 bp，被置换的碱基片段长1704 bp，插入含miRVASP DNA表达片段约64 bp+936 bp=1000 bp。因此重组质粒长约7984 bp。将重组质粒PCR产物进行测序，证实表达载体成功构建。
2.4 慢病毒表达颗粒的包装
将慢病毒表达载体pLenti6/V5-miRVASP与慢病毒包装混合物共转染293FT细胞48 h后，在荧光显微镜下观察。分别可见较多量细胞表达强绿色荧光，见图3。证实质粒转染入293FT细胞，细胞部分融合，可见多核复合体出现，细胞内可见多量病毒颗粒。
2.5 慢病毒能侵染胃癌细胞株BGC-823
将收集的携带miRVASP DNA表达片段的慢病毒颗粒侵染BGC-823胃癌细胞。24 h及48 h后，荧光显微镜下观察。镜下分别可见较多量的BGC-823细胞表达强绿色荧光，见图4。证实包装产生的慢病毒颗粒能侵染BGC-823细胞。
3 讨论
肌动蛋白细胞骨架介导了许多细胞生命活动，包括细胞黏附、细胞运动和细胞形态改变。肌动蛋白细胞骨架的功能失调与肿瘤的发生与转移密切相关。如肌动蛋白结合蛋白（actin binding proteins，ABPs）在肿瘤中的表达失调[11-12]。VASP是一种涉及细胞膜突起动力学的肌动蛋白结合蛋白[13]。VASP主要位于层状伪足前导端、丝状伪足顶端和黏附斑。在细胞迁移的层状伪足前导端，VASP作为脚手架蛋白将伸长的F-actin与ABPs结合，调节由肌动蛋白聚合驱动的伪足形成和稳定。在丝状伪足顶端，VASP在F-actin倒刺末端施加抗盖帽力，促进丝状伪足形成和伸长。VASP通过重排细胞骨架，并促进F-actin伸长和成束，成为启动和维持伪足区域的关键抗盖帽蛋白[14-15]。因此，VASP在重要的生理和病理過程中发挥重要作用，包括损伤修复、神经元发育等生理过程，以及炎症、肿瘤浸润转移等病理过程。
VASP與肿瘤细胞运动性密切相关。将NIH3T3成纤维细胞中VASP敲除和过表达均能诱导细胞致瘤性转化[16-17]。VASP在肺腺癌中过表达与肿瘤分期相关[5]。VASP沉默后，下调β-连环蛋白表达，影响乳腺癌细胞侵袭[6]。VASP磷酸化在肿瘤侵袭中也发挥关键作用[9，18-19]，其机制可能涉及基因的表达调控[20]。不同的研究结果显示，VASP与肿瘤瘤变和转移有关，但其分子机制尚未阐明。我们在前期研究中，发现VASP与胃癌细胞迁移和侵袭相关[10]。
慢病毒载体法有着其他转基因技术不可比拟的优势。本研究将慢病毒载体包装、包膜和目的载体三部分质粒共转染293FT细胞，获得慢病毒原液。Gateway技术以λ噬菌体位点特异重组反应为基础，平移目的序列到目的载体。本研究选取了携带有attB位点的pcDNA6.2-GW/EmGFP载体，与携带有attP位点pDONRTM221载体进行BP反应，构建带有目的基因的入门克隆。然后，将入门克隆与目的载体进行LR反应，构建了携带靶向VASP基因的RNA干扰表达框miRVASP的慢病毒表达载体。接着，分别将慢病毒表达载体与包装混合物共转染239FT细胞，收集细胞上清液，浓缩后，即得到了高滴度、无复制能力和具有良好生物安全性的病毒原液。本实验为进一步对胃癌细胞进行高效侵染，在体内实验中研究VASP在胃癌转移中的作用奠定了基础。
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（收稿日期：2018-03-23 本文編辑：任 念）