转CmCSA基因双链RNA水稻的RNAi效应鉴定
摘 要：稻纵卷叶螟是危害水稻的主要害虫之一，几丁质合成酶是昆虫几丁质合成通路上最后一个酶，对昆虫的生长发育至关重要。本研究对转稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因双链RNA（dsCmCSA）水稻进行了室内和田间RNA干扰（RNAi）效应鉴定。结果表明，相比于对照组，取食转dsCmCSA水稻的稻纵卷叶螟体型变小，蜕皮困难，出现畸形表型，死亡率明显增加。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析表明，取食转基因水稻株系CAⅡ-5的幼虫体内CmCSA表达量比对照组下降了54.00%。田间实验结果表明，转基因水稻株系CAⅡ-5的卷叶率和白叶率分别为7.98%和5.04%，与对照组差异显著。转dsCmCSA水稻具有明显的RNAi效应，抗虫效果较好。该研究为利用转基因RNAi技术对稻纵卷叶螟进行绿色防控奠定基础。
关键词：稻纵卷叶螟;几丁质合成酶A;RNA干扰;抗虫性
中图分类号：Q966
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2018）06-0036-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.007
水稻是一种主要的谷类粮食作物，全球有一半以上的人口以大米为食。我国是主要的稻米生产国和消费国之一，因此，水稻的丰产和我国经济的发展具有紧密的联系。稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis），俗称卷叶虫、苞叶虫等，属于鳞翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是危害水稻的四大害虫之一，严重影响水稻的产量[1-2]。稻纵卷叶螟是一种典型的迁飞性害虫，目前对该虫的防治方法主要是喷洒农药，但由于长期使用化学药物，不仅带来严重的“3R”问题，还使得粮食的安全问题日益突显。因此，寻找一种绿色、环保、经济的害虫防治方法迫在眉睫。
几丁质（chitin）是存在于自然界中的一类天然多聚物，是昆虫外骨骼、气管、中肠等组织的重要组分，对昆虫的生长发育和繁殖等生理过程具有重要作用[3]。昆虫几丁质的合成是一个由多种酶参与调控的复杂过程，其中几丁质合成酶（chitin synthase）是几丁质合成通路中最后一个酶，能催化UDP-N-乙酰氨基葡糖形成几丁质多聚物，在几丁质合成过程中至关重要，是控制害虫的理想靶标。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是机体抵抗病毒或其它外来核酸入侵的重要保护性机制，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）抑制细胞内与其同源基因的表达，导致转录后基因沉默现象（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[4]。由于RNAi作用具有高度的特异性、高效性和放大效应，已经被广泛应用于如抗人体病毒研究、肿瘤治疗、植株品种改良等生物领域[5]。在昆虫学中，RNAi技术主要用于基因功能研究以及害虫的防治，研究者将体外合成靶标基因的dsRNA或小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）通过饲喂、注射、转基因等方式导入昆虫体内引发RNAi效应，获得目标基因的生理缺陷，从而一方面可鉴定昆虫基因功能，另一方面也达到防治害虫的目的。Chen等[6]通过RNAi沉默甜菜夜蛾Spodoptera exigua 几丁质合成酶A基因（SeCSA），昆虫的生长发育受到抑制，出现蜕皮障碍、表皮几丁质层不能正常形成、气管发育畸形等现象。Mao等[7]利用转基因技术将细胞色素P450基因导入棉花中，棉铃虫 Helicoverpa armigera在取食表达靶标基因dsRNA的转基因棉花后出现发育迟缓症状。应用 RNAi 技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害，在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。
本实验室利用植物转基因技术，获得表达稻纵卷叶螟几丁质合成酶A（CmCSA）基因dsRNA （dsCmCSA）的转基因水稻。本研究用转基因水稻子一代植株叶片分别在室内和田间饲喂稻纵卷叶螟3龄幼虫，鉴定转基因水稻株系的RNAi效应，旨在为利用转基因RNAi防治稻纵卷叶螟奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫与水稻
供试昆虫稻纵卷叶螟由本实验室饲养[8]。在人工气候箱内用稻苗饲养，饲养条件为：温度（26±1）℃，相对湿度70%～80%，光周期14L∶10D。供试水稻为本实验室种植的转dsCmCSA 的中花11。
1.2 引物设计
利用Primer 6.0根据转基因水稻靶标片段设计特异性PCR引物，同时针对CmCSA的开放阅读框序列设计实时荧光定量PCR（RT-qPCR）引物（表 1），检测取食转基因水稻植株的稻纵卷叶螟CmCSA基因mRNA表达水平。以稻纵卷叶螟看家基因CmActin（GenBank登录号：JN029806）为内参对照。
1.3 转dsCmCSA水稻的PCR检测
采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法分株提取8个转dsCmCSA水稻子一代株系（CAⅠ-3.1、CAⅠ-3.2、CAⅡ-2、CAⅡ-3.1、CAⅡ-3.2、CAⅡ-4.1、CAⅡ-4.2和CAⅡ-5）的DNA，以其為模板，利用表1中的引物，进行PCR扩增，检测水稻植株中是否存在转入的目标序列。反应条件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共36个循环，72℃ 延伸10 min，10℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 室内抗虫性检测
用叶片测定法进行RNAi水稻的室内抗虫性鉴定。分别剪取8个转dsCmCSA水稻株系的5片叶，用浸有保鲜液的棉花包裹好后放入不同的玻璃直管（12 cm×3 cm）中，每管接15头稻纵卷叶螟3龄幼虫，将玻璃直管两端用纱布封口，然后将玻璃直管置于条件为：温度（26±1）℃，相对湿度70%～80%，光周期14L∶10D的人工培养箱，每天定时在直管两端喷洒保鲜液，3 d更换一次叶片。用正常水稻作为对照，每组设3个重复。每隔24 h，观察记录幼虫取食、表型及存活情况。
1.5 死亡率與校正死亡率
稻纵卷叶螟取食转dsCmCSA水稻后，检测CmCSA敲低对稻纵卷叶螟生长的影响。在接虫7 d后统计死亡率和校正死亡率，死亡率计算公式：死亡率=死亡虫数/总虫数×100%;校正死亡率计算公式：校正死亡率=（实验组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率） ×100%。
1.6 CmCSA基因沉默效应检测
为了更精确地检测RNAi效应，使用RT-qPCR技术检测取食转dsCmCSA水稻植株的稻纵卷叶螟体内CmCSA的mRNA表达水平，以CmActin为内参对照。在稻纵卷叶螟3龄幼虫取食转dsCmCSA水稻植株叶片7 d 后，分别收集实验组和对照组玻璃直管中各2头存活的幼虫，用HP Total RNA Kit（Omega Bio-tek，USA）分别提取总RNA，具体步骤按照说明书进行操作。用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分别检测总RNA的完整性和纯度。按照PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa，China）试剂盒说明书，取1 μL总RNA反转录合成第一链cDNA。反转录体系为20 μL：1 μL RNA，1 μL Olige （dT）18 Primer，4 μL 5×Reaction Buffer，1 μL RNase Inhibitor（20 U/μL），2 μL dNTP Mixture，1 μL Revert Aid M-MuLV RTase （200 U/μL），10 μL RNase free Water。反应条件为：42℃ 60 min，70℃ 5 min。然后以cDNA为模板在C1000 qPCR仪上进行RT-qPCR检测。PCR反应体系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad，USA），补加灭菌水到总体积20 μL。反应条件为：95℃预变性1 min，95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，进行40个循环。采用CFX Manager软件（Bio-Rad，USA）进行实验数据记录与分析。
1.7 田间抗虫性检测
将转dsCmCSA水稻以小区块种植于惠水县试验田，选25株罩上尼龙网，至分蘖盛期（7月下旬），在每个网中的水稻上人工接种50头稻纵卷叶螟低龄幼虫，30 d后统计水稻的卷叶率和白叶率。平均每株卷叶率=卷叶数/网中水稻叶片总数/25;平均每株白叶率=白叶数/网中水稻叶片总数/25。每个处理重复3次，以正常水稻作为对照。
1.8 数据与分析
采用2-ΔΔCt 法分析稻纵卷叶螟取食转dsCmCSA水稻叶片后，其体内CmCSA基因的mRNA相对表达量。结果以平均值±标准差表示，根据数据绘制柱形图。采用SPSS 22.0统计软件中的方差分析（ANOVA）的最小显著性差异（LSD）法进行多重比较检验（P <0.05）。
2 结果与分析
2.1 转dsCmCSA水稻的外源DNA片段检测
以不同转dsCmCSA水稻植株的DNA为模板，进行PCR检测，电泳结果显示转dsCmCSA水稻子一代植株存在靶标DNA片段，可以用于后续的抗虫性鉴定实验。
2.2 CmCSA基因mRNA表达水平
在稻纵卷叶螟幼虫取食转dsCmCSA水稻7 d 后，分别提取实验组和对照组稻纵卷叶螟总RNA，进行RT-qPCR检测。结果显示，在取食8个不同转dsCmCSA水稻植株后，稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的表达水平明显下降，与对照组相比，差异显著。因此，取食转dsCmCSA水稻后，稻纵卷叶螟体内CmCSA基因具有明显的沉默效应。
2.3 取食和表型变化
接虫后每隔24 h观察稻纵卷叶螟幼虫的取食情况，检测转dsCmCSA水稻子一代株系对试虫的RNAi效应。结果显示，在取食表达CmCSA dsRNA水稻叶片24 h后，稻纵卷叶螟幼虫的取食情况和对照组没有明显差异;但48 h后，实验组幼虫出现明显的拒食现象，而对照组水稻叶片被大量取食。在接虫7 d后，实验组幼虫明显小于对照组，蜕皮困难，出现畸形和死亡现象;部分存活幼虫也不能正常化蛹，即使能够化蛹，但是蛹明显小于对照组或出现畸形。这些结果表明，取食转dsCmCSA水稻叶片后，稻纵卷叶螟幼虫活力降低，生长发育受阻。
1，4：取食正常水稻叶片的幼虫; 2：取食转基因水稻叶片的幼虫变小; 3：取食转基因水稻叶片的幼虫出现畸形;5，7，9：取食正常水稻叶片的幼虫能正常化蛹;6，8：取食转基因水稻叶片的幼虫不能化蛹;10：取食转基因水稻叶片的幼虫化成的蛹变小
2.3 死亡率与校正死亡率
接虫7 d 后，统计实验组和对照组幼虫存活情况，结果表明，在分别取食8个转基因水稻植株7 d后，相较于对照组（701），稻纵卷叶螟死亡率大幅增加，实验组与对照组差异显著（表2）。这些结果表明，RNAi效应明显，转基因水稻子一代株系对稻纵卷叶螟产生明显的致死效应。
2.5 田间抗虫性检测
在田间人工接虫30 d后，转基因水稻株系的卷叶率和白叶率明显少于对照组（表3），二者之间差异显著。结果表明，转dsCmCSA水稻能引发RNAi效应，稻纵卷叶螟选择性拒食这些转基因水稻。
3 结论与讨论
几丁质是昆虫体壁、中肠、气管等多个组织的重要组成成分，对昆虫的生长发育、蜕皮、繁殖具有重要作用。几丁质的合成是一个有多种酶参与调控的复杂过程，几丁质合成酶是几丁质合成通路上的最后一个酶，对昆虫几丁质的合成至关重要。几丁质合成酶是无脊椎动物体内特有的酶，故常被作为潜在绿色杀虫剂的理想靶标。本研究中，通过给稻纵卷叶螟饲喂表达CmCSA基因dsRNA的转基因水稻叶片，可以观察到试虫生长发育受阻，蜕皮困难，并出现畸形，最终导致死亡;部分能完成蜕皮，体型比对照组幼虫小，无法继续生长至化蛹;或者能够化蛹，但是蛹的大小明显小于对照组或发育为畸形蛹。RT-qPCR检测结果表明，CmCSA基因被有效沉默，mRNA表达水平显著低于对照组。我们推测出现上述结果的原因可能是由于CmCSA表达下降，几丁质合成通路紊乱，几丁质含量降低，影响新表皮的形成，导致试虫蜕皮困难，发育阻滞。Chen等[6]发现SeCSA表达被抑制之后，甜菜夜蛾生长发育受到阻碍，虫体无法正常完成蜕皮，即使完成蜕皮，虫体小于正常幼虫，无法继续生长至蛹。Arakane 等[9]干扰赤拟谷盗Tribolium castaneum几丁质合成酶基因（TcCHS1），发现TcCHS1能影响幼虫-幼虫，幼虫-蛹和蛹-成虫的蜕皮，且对于昆虫的繁殖和卵的孵化都有影响。Zhang 等[10]研究发现，飞蝗Locusta migratoria 2 龄若虫LmCHS1 （LmCHSA）被抑制后，飞蝗蜕皮时新旧表皮难以分离，无法正常完成蜕皮，最终死亡。以上研究结果表明，CSA在昆虫的生长发育过程中至关重要，该基因表达下降直接影响昆虫的正常生长发育。
自2001年Johansen首次通過构建了具有绿色荧光蛋白基因（GFP）回文序列的重组质粒，并将其转入烟草中成功表达dsRNA，成功沉默转GFP基因烟草中的荧光信号以来，培育表达dsRNA的转基因作物技术已逐渐成熟，并已经被用于研究多种植食性昆虫的防治[12]。2007年，Baum等[13]通过饲喂表达V-ATP基因dsRNA的转基因玉米，发现玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera发育迟缓，死亡率升高，显著减少其对玉米的为害，对玉米有显著的保护作用;同年Mao等[7]将棉铃虫H.armigera中与解毒代谢直接相关的CYP6AE14 dsRNA在拟南芥和烟草上成功表达，使得取食转基因植物的棉铃虫CYP6AE14基因表达受到抑制，从而使棉铃虫对棉子酚的抗性显著降低，导致其出现发育迟缓症状。这两项研究结果表明，通过RNAi介导的转基因植物用于害虫控制有巨大的潜能。在此之后，RNAi介导的转基因植物已经成功被用于多种害虫的防治。如Han等[14]饲喂棉铃虫H.armigera表达dsHaHR3的棉花，导致棉铃虫畸形并大幅死亡，棉花产量大幅增加;Zha等[15]通过在水稻中表达褐飞虱Nilaparvata lugens中肠里高表达的3个基因NlHT1、Nlcar和Nltry，取食转基因水稻的褐飞虱，这3个基因均有效地被沉默;Mao等[16]研究发现，取食表达hunchback基因dsRNA的转基因烟草后，烟蚜Myzus persicae繁殖受阻，hunchback基因的表达显著被抑制。上述研究表明，选择合适的靶标基因，通过植物介导的RNAi沉默昆虫体内的特定基因表达，能够控制虫害的发生，这将有效减少化学农药的使用，降低环境污染，为作物害虫防治开辟了新的领域。
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