单向灌流法评价复方龙脉宁汤剂配伍对葛根素肠吸收的影响
[摘要]建立大鼠在体单向肠灌流模型，采用高效液相色谱法测定灌流液中葛根素的浓度，考察葛根、葛根穿山龙、葛根川芎和复方龙脉宁4种汤剂在十二指肠、空肠、回肠和结肠中葛根素的吸收情况。结果显示在十二指肠和回肠中，葛根穿山龙组与复方龙脉宁组葛根素的吸收参数无显著性差异，但均显著高于葛根和葛根川芎组的吸收（P<005）；在空肠和结肠中，3个配伍组中葛根素的吸收参数与葛根单药组相比，存在显著性差异（P<005），而复方龙脉宁组中葛根素的吸收参数与葛根穿山龙和葛根川芎组相比也存在显著性差异（P<005）。表明在大鼠全肠段中，复方龙脉宁汤剂对葛根素的吸收有明显的促进作用。在十二指肠和回肠中，复方中穿山龙对葛根素的吸收有明显的促进作用；在空肠和结肠中，穿山龙和川芎能协同促进葛根素的吸收。
[关键词]葛根素； 复方龙脉宁； 配伍； 单向灌流模型； 重量法Effect of compound
中药无论是单味药还是复方，均含有众多的化学成分，多成分是中药制剂临床使用的基本特征，但是单味药在临床应用中往往存在活性成分生物利用度低、吸收差的问题，而复方配伍后药物之间会发生某些相互作用并产生不同的效用，能够改善有效成分的生物利用度[13]。
复方龙脉宁方（FFLMN）由葛根、穿山龙、川芎、蜂胶4味中药组成，具有通络活血、化瘀解毒的功效，临床上主要用于治疗中风所致的半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜和胸痹所致的胸闷气短、心悸、失眠等症[4]。葛根为全方君药，其主要有效成分葛根素具有扩张冠状动脉及脑血管、改善心肌代谢、改善脑部微循环、抗心律失常、降低血压、抑制肿瘤细胞生长等作用[45]。但是葛根素水溶性较差，口服后难以被吸收，绝对生物利用度只有375%左右[5]。因此本试验采用大鼠在体单向灌流模型，考察葛根、葛根穿山龙、葛根川芎和复方龙脉宁4种汤剂在十二指肠、空肠、回肠和结肠中对葛根素吸收的影响，探讨中药复方用药与单味用药的吸收差异，说明中医复方配伍用药的科学性。
1材料
UltiMate3000液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific）；BT1001F型蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；AR1140电子天平（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；HH2型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；X1型高速离心机（Gene Company Limited）。
蜂胶，陕西省咸阳市自然之子蜂产品公司，经陕西中医药大学药学院生药教研室雷国莲教授鉴定为正品蜂胶；葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，纯度≥98%，批号110752201514）；乌来糖（上海山浦化工有限公司）；氯化钠注射液（辰欣药业股份有限公司）；乙腈（色谱纯，Thermo Fisher Scientific）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。葛根饮片，宝鸡向源中药饮片有限责任公司，批号20160301，经陕西中医药大学药学院生药教研室王继涛教授鉴定为豆科植物野葛的干燥根茎；穿山龙饮片、川芎饮片（西安盛兴中药饮片公司，批号20160301）。
SD雄性大鼠，体重（250±20） g，由西安交通大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（陕）2012003。适应性饲养1周，实验前禁食12 h，自由饮水。
2方法与结果
21汤剂的制备
211复方龙脉宁汤剂取葛根6 g，穿山龙4 g，川芎4 g，蜂胶2 g，分别加14倍量纯净水浸泡60 min。葛根先煎30 min，蜂胶除蜡[6]，而后将4味药合并煎煮（先武后文）2次，第1次30 min，第2次20 min，合并煎煮濾液，浓缩至50 mL，即得复方龙脉宁汤剂（FFLMN）储备液。
212方药不同配伍汤剂A：葛根6 g；B：葛根6 g穿山龙4 g；C：葛根6 g川芎4 g。分别按与FFLMN相同煎煮方法制备，即得葛根汤剂（GG）、葛根穿山龙汤剂（GGCSL）、葛根川芎汤剂（GGCX）储备液。
213汤剂中葛根素含量测定FFLMN及其不同配伍汤剂中葛根素的含量按照文献[7]条件测定。结果表明葛根、葛根穿山龙、葛根川芎和复方龙脉宁4种汤剂中葛根素的质量浓度分别为30，21，24，28 g·L-1。
22溶液的配制
221Krebsringer试液（KR缓冲液）[8]称取NaCl 78 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g，加蒸馏水定容至1 L，即得。
222葛根素对照品的配制精密称取葛根素对照品75 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制成质量浓度为300 mg·L-1的葛根素对照品储备液。
223肠灌流液的配制分别移取GG，GGCSL，GGCX，FFLMN汤剂储备液适量于100 mL量瓶中，KR液稀释定容至刻度，得葛根素质量浓度约为50 mg·L-1的GG，GGCSL，GGCX，FFLMN肠灌流液。
23分析方法的建立
231色谱条件[7]BDS HYPERSIL C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈01%磷酸溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长203 nm；流速10 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL。
242数据分析本试验采用重量法对供试液流入和流出的体积进行校正，并计算药物吸收常数（Ka）和表观吸收常数（Papp）。
Ka=1-ρoutρin×VoutVin×Qπr2l
Papp=-Qlnρoutρin×VoutVin2πrl
其中，Vin和Vout分别为肠段灌入的灌流液和收集液的体积（mL）（假定灌流液和收集液的密度相同），l和r分别为灌流肠段的长度（cm）和横截面半径（cm），Q为灌流速度（mL·min-1），ρin和ρout分别为灌流液和收集液的质量浓度（mg·L-1）。
243统计学分析采用SPSS190软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），当 P<005时判定具有显著差异，结果以±s表示，组间差异的比较采用t检验。
244不同配伍组中葛根素在十二指肠中的吸收取葛根素质量浓度约为50 mg·L-1的不同配伍组肠灌流液，按241项下方法操作，计算各配伍组中葛根素在十二指肠的吸收参数，结果见表3，4。在十二指肠中，葛根穿山龙组与复方龙脉宁组中葛根素的吸收参数无显著性差异，但与葛根组和葛根川芎组比较均有显著性差异（P<005）。表明复方中穿山龙对葛根素的吸收起主要促进作用。
245不同配伍组中葛根素在空肠中的吸收取葛根素质量浓度约为50 mg·L-1的不同配伍组肠灌流液，按241项下方法操作，计算各配伍组中葛根素在空肠的吸收参数，结果见表3，4。在空肠中，葛根穿山龙、葛根川芎及复方组中葛根素的吸收均高于葛根组，统计学分析表明其具有显著性差异（P<005）；而复方组与葛根穿山龙、葛根川芎组比较，葛根素的吸收也存在显著性差异（P<005）。结果表明复方中穿山龙、川芎对葛根素的吸收起协同促进作用。
246不同配伍组中葛根素在回肠中的吸收取葛根素质量浓度约为50 mg·L-1的不同配伍组肠灌流液，按241项下方法操作，计算各配伍组中葛根素在回肠的吸收参数，结果见表3，4。在回肠中，葛根穿山龙组与复方龙脉宁组中葛根素的吸收参数无显著性差异，但较葛根组与葛根川芎组均有显著性差异（P<005）。结果表明复方中穿山龙对葛根素的吸收起主要促进作用。
247不同配伍组中葛根素在结肠中的吸收取葛根素质量浓度约为50 mg·L-1的不同配伍组肠灌流液，按241项下方法操作，计算各配伍组中葛根素在结肠的吸收参数，结果见表3，4。在结肠中，葛根穿山龙、葛根川芎及复方组中葛根素的吸收均高于葛根组，统计学分析表明其具有显著性差异（P<005）；而复方组与葛根穿山龙、葛根川芎组比较，葛根素的吸收也存在显著性差异（P<005）。结果表明复方中穿山龙、川芎对葛根素的吸收起协同促进作用。
3讨论
研究药物吸收的方法主要有在体法、离体法和体内法。相比于后2种方法，在体法因不切断血管和神经系统，提高了肠段的生物活性，因此被广泛应用到药物吸收的研究中[13]。在体肠道单向灌流常用的体积校正方法有：酚红法和重量法。重量法因其真实地反映了肠道水分吸收情况而突显出一定的优势[14]。因此，本实验采用在体法研究复方汤剂配伍对君药葛根中葛根素肠吸收的影响，并利用重量法对灌流前后体积进行校正。
中药配伍有减毒增效作用，目前研究主要集中在中药配伍改善活性成分的药理效应上[1516]，而本文从吸收的角度研究中药配伍后对活性成分的影响效果。结果显示在大鼠全肠段中，复方龙脉宁汤剂对葛根中葛根素的吸收有明显的促进效果。通过进一步研究发现，在十二指肠和回肠中，复方中穿山龙对葛根素的吸收起到了明显的促进作用；而在空肠和结肠中，复方中穿山龙和川芎对葛根素的吸收起到了协同促进作用。这在一定程度上体现了复方龙脉宁配伍的科学性，同时也说明了中药复方配伍用药的意义之所在。
但是本文略显不足之处是并未对穿山龙、川芎促进葛根素吸收的机制进行相关研究，因此后续研究中可针对此方面进行相关研究探讨。
[参考文献]
[1]刘洋，王刚，董玲，等 中药生物药剂学分类系统中多成分环境对葛根素渗透性的影响[J] 中国中药杂志，2014，39 （23）：4505
[2]陈益杭，李孟璇，孟兆青，等 药对研究（Ⅲ）葛根人参药对对大鼠肠吸收的影响[J]中国中药杂志，2015，40 （15）：3094
[3]郭震浪，苏振宁，戴韵峰，等葛根芩连汤治疗小儿轮状病毒性肠炎疗效的Meta分析[J]中国实验方剂学杂志，2015，21（24）：199
[4]董林娟，张文娟，刘诗雨，等 龙脉宁方中葛根素在心肌缺血大鼠体内药动学药效学相关性研究[J] 中国中药杂志，2016，41（8）：1535
[5]黄嗣航，龙晓英，袁飞，等 酚红法和改良重量法分别研究葛根素的大鼠在体肠吸收机制[J] 广东药学学报，2012，28 （6）：603
[6]马海芳，王昌利，史亚军 蜂胶除蜡工艺研究[J] 中南药学，2014，12 （5）：448
[7]王莎，王昌利，史亞军 复方龙脉宁HPLC指纹图谱的研究[J] 中华中医学刊，2015，33 （1）：89
[8]陈新民，李俊松，李文，等 五味子有效成分的大鼠在体单向灌流肠吸收[J] 药学学报，2010，45 （5）：652
[9]Sun M H， Zhai X Z， Xue K W， et al Intestinal absorption and intestinal lymphatic transport of sirolimus from selfmicroemulsifying drug delivery systems assessed using the singlepass intestinal perfusion（SPIP） technique and a chylomicron flow blocking approach：linear correlation with oral bioavailabilities in rats[J].Eur J Pharm Sci， 2011， 43（3）：132
[10]Zuo Z， Zhang L， Zhou L M， et al Intestinal absorption of hawthorn flavonoids——in vitro， in situ and in vivo correlations[J] Life Sci， 2006， 79 （26）：2455.
[11]饶小勇，龚明，尹珊，等 白头翁皂苷D在大鼠肠道的吸收行为研究[J] 中草药，2013，44（24）：3515
[12]王进荣，王平，杨永茂，等 单向灌流法评价芦荟大黄素大鼠体内肠吸收的研究[J] 中国中药杂志，2011，36 （17）：2393
[13]邓少东，张鹏，林励，等 单向灌流法研究巴戟天低聚糖的大鼠肠吸收特性[J] 中国中药杂志，2015，40 （1）：134
[14]刘诗雨，柏希慧，董林娟，等 基于单向灌流法的葛根素羧甲基壳聚糖微球肠吸收特性研究[J] 中草药，2016，47 （14）：2488
[15]汪汀，冯芳 单向灌流法评价栀子厚朴汤方剂配伍对栀子苷肠吸收的影响[J] 药学与临床研究，2012，20 （3）：177
[16]李桓，周学平，陆艳基于代谢组学的中药配伍减毒研究策略探讨[J]中国实验方剂学杂志，2015，21（8）：226[责任编辑曹阳阳]
刘群等：麝香保心丸中5种人参皂苷类化合物在心肌梗死大鼠血浆中的药代动力学研究
[收稿日期]20160823
[基金项目]国家自然科学基金项目（81473327）
[通信作者]*柳润辉，教授，博士，主要从事天然产物活性成分和中药复方药效物质基础及作用机制研究，Tel：（021）81871245，Email：lyliurh@126com