MYH9蛋白在胃癌中的表达及其临床意义
【摘要】 目的：探讨MYH9蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组化及Western blot法检测胃癌及癌旁组织中MYH9蛋白的表达水平，分析其临床病理参数之间的关系。结果：MYH9蛋白在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）。胃癌组织MYH9蛋白的表达在Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.009），淋巴结转移胃癌的MYH9蛋白表达明显高于无淋巴结转移 （P=0.019）。结论：MYH9蛋白在胃癌组织中表达增高，参与了肿瘤的转移过程。
【关键词】 胃癌； MYH9； 免疫组化
【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of MYH9 protein in human gastric carcinoma.Method：The expression of MYH9 in gastric carcinoma and paraneoplastic were evaluated by immunohistochemical and Western blot，then analyzed its association with clinical pathology.Result：The expression of MYH9 in gastric carcinoma was higher than paraneoplastic（P<0.05）.The expression of MYH9 protein in stage Ⅲ-Ⅳ of gastric cancer tissues was significantly higher than that of stage Ⅰ-Ⅱ（P=0.009） and the expression of MYH9 protein in lymph node metastasis of gastric cancer was significantly higher than that of without lymph node metastasis （P=0.019）.Conclusion：Higher expression of MYH9 in gastric carcinoma may play an important role in tumor metastasis.
【Key words】 Gastric carcinoma； MYH9； Immunohistochemical
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.010
胃癌是全球最常見的肿瘤之一，我国是胃癌的高发区，发病率和死亡率居第二位和第三位，明显高于世界平均水平[1-3]。目前胃癌的诊断和治疗已经取得很大进步，而其发病率和死亡率仍无明显降低，主要原因是胃癌常发生侵袭和转移，且治疗后容易复发。胃癌发生转移的病因受环境因素及多种分子基因的调控。非肌性肌球蛋白重链-9基因（myosin heavy chain 9，nonmuscle，MYH9）定位于人染色体22q13.1，表达产物是非肌性肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosin Ⅱ，NMⅡ），属于肌球蛋白（myosin）超家族[4]。MYH9在细胞极化、迁移、粘附中均有重要作用[5-8]。为了解MYH9在肿瘤的发生发展过程中的作用，本文初步探讨了MYH9蛋白在胃癌组织中的表达，以判断MYH9蛋白在胃癌侵袭转移中发挥的作用。现报道如下
1 资料与方法
1.1 标本收集与试剂 2013年12月-2015年6月赣南医学院第一附属医院手术切除并经病理证实为胃癌的石蜡包埋标本86例。患者术前均未接受放疗和化疗，均经病变组织活检，诊断为胃癌。男55例，女31倒；平均年龄（59.0±4.8）岁。其中高、中分化腺癌57例，低分化腺癌29例；有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者50例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期42例。同时取距癌组织边缘5 cm以上的癌旁胃组织20例作为对照组。抗人MYH9多克隆抗体购于Sigma公司，PV-9000试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 免疫组织化学法 所有标本应用SP法进行免疫组织化学染色，对证实为胃癌石蜡包埋的标本行4 µm厚切片，每例连续作3张切片。一张行HE染色，以观察细胞分化程度等病理特征。一张作阴性对照，用PBS溶液代替一抗。另一张行MYH9免疫组化染色。病理特征和免疫组化的结果由两位病理科医师独立单盲阅片。随机选取5个视野，MYH9免疫组化染色阳性物质主要定位于细胞浆内，呈棕黄色细颗粒状。蛋白表达评估标准为：（1）按阳性染色细胞百分率计分：阳性细胞百分率≤5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；（2）按染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色为弱表达，2分为黄色为中表达，3分为棕黄色或黄褐色为强表达。免疫染色指数（staining index，SI）=阳性染色细胞百分率×染色强度。在本研究中，设定SI≤6分为低表达，SI>6分为高表达。
1.3 Western blot法 取术后新鲜病理标本，在肿瘤组织和癌旁组织进行取材，通过BCA法测定蛋白水平。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后， 将获得样品加入SDS缓冲液中，上样，待溴酚蓝跑至底部，进行转膜后封闭、免疫反应观察MYH9蛋白表达情况，以β-actin为内参。照相后行图像分析。
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验及列连表相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MYH9蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达 免疫组化结果显示：MYH9主要在胃癌细胞的胞浆中表达（图1）。86例胃癌组织，39例（45.3%）低表达，47例（54.7%）高表达；20例癌旁组织，15例（75.0%）低表达，5例（25.0%）高表达。MYH9在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差 异有统计学意义（P=0.017）。Western blot结果显示，对20组胃癌组织及癌旁组织进行了Western blot检测，其中13组癌组织比癌旁组织蛋白表达量高（图2），7组癌组织MYH9蛋白表达不高于癌旁组。进一步用秩和检验进行分析，发现胃癌组织中MYH9蛋白的表达高于癌旁组织（15.68% vs 7.19%），差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 MYH9蛋白在胃癌中的表达与临床病理参数之间的关系 MYH9蛋白表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化程度无关（P>0.05），胃癌组织MYH9蛋白的表达在Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.009），淋巴结转移胃癌的MYH9蛋白表达明显高于无淋巴结转移（P=0.019），见表1。
3 讨论
胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤。由于各种因素，我国大部分胃癌诊断时已是中晚期，目前的治疗方式主要是以手术治疗为主的综合治疗，然而仍有60%的患者依然出现复发转移[9]。因此，了解胃癌的侵袭转移的分子机制，是胃癌研究者面临的重大课题[10-11]。Liang等[12]通过体内和体外实验研究发现Let-7f 通过介导MYH9基因从而抑制胃癌细胞GC9811的侵袭与转移，这为胃癌侵袭转移的机制研究又提供了一关联基因。为此，本文初步探讨MYH9蛋白在胃癌组织中的表达，用以明确MYH9蛋白在胃癌侵袭转移中发挥的作用。
肌球蛋白（myosin）超家族可与肌动蛋白相结合，利用ATP水解的能量，沿着微丝移动，参与细胞内的各种功能都相关[13]。研究发现，MYH9特异的存在于血小板、淋巴细胞和中性粒细胞中，参与了细胞的运动和趋化。它还与其他蛋白相互作用，促进细胞定向的运动，调节肿瘤细胞的迁移和血管的生成[14-15]。而這些作用主要是由MYH9基因编码的NMIIA族分子完成的。NMIIA通过组装成肌球蛋白牵引整个细胞，形成类蜂窝结构，收缩细胞体向前运动，解离附着在细胞后部的尾巴，从而达到细胞的收缩和前行运动[16]。是否MYH9在肿瘤的发生发展过程中也是通过NMIIA族分子发挥作用的仍不清楚。目前MYH9基因与肿瘤的生物学行为研究一直是热点之一。MYH9蛋白是表达儿童间变性大细胞淋巴瘤激酶的融合基因[17]，在乳癌和黑色素瘤细胞系中MYH9蛋白又是依赖其他因子的表达[18]。进一步研究显示，MYH9是肿瘤的候选癌基因，在肺癌和大肠癌的侵袭转移中发挥重要的作用[19-21]。
本课题中对胃癌及癌旁组织中进行MYH9的免疫组化检测，结果发现MYH9在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。Western blot法是分子生物学和生物化学等领域研究中常用的一种实验方法，常用来分析基因在蛋白水平的表达情况。笔者进一步通过Western blot的方法验证在胃癌组织和癌旁组织中MYH9蛋白的表达情况，结果也表明MYH9蛋白在胃癌组织中的表达是上调的，从另一个角度也验证了蛋白质组学结果的可靠性和准确性。同时笔者还分析了MYH9蛋白在胃癌中的表达与临床病理参数之间的关系，统计学分析提示MYH9蛋白表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化程度无关，而与临床分期及淋巴结转移有相关性。同时也发现在转移性淋巴结胃癌组织中，高表达的MYH9蛋白有69.4%，预示着MYH9蛋白可能在胃癌的淋巴结转移过程发挥着重要作用。MYH9在胃癌组织中的表达可作为肿瘤诊断和判断预后的标志物之一，但其作用机制是否也是通过结合NMIIA族分子，这也是医务工作者进一步亟待研究的。
肿瘤的侵袭转移是一个多步骤的复杂过程，本研究通过免疫组织方法初步探讨了MYH9在胃癌侵袭和转移中发挥了作用。下一步，还将采用多种实验方法进一步研究MYH9蛋白在胃癌侵袭和转移中的作用机制。期待能够找到一种有效判断进展期胃癌转移相关基因的靶标，对于预测胃癌侵袭转移的诊治及预后具有非常重要的意义，为指导胃癌亚临床转移的合理防治提供理论依据。
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（收稿日期：2017-08-10） （本文编辑：程旭然）
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