ARTP-NTG复合诱变选育高产中性蛋白酶菌株

计划（2017YFB0308400）。

作者简介 钱娟娟（1983—），女，山东威海人，工程师，硕士，从事酶制剂生产与开发工作。通信作者，工程师，硕士，从事酶制剂生产与开发工作。

收稿日期 2019-05-16

中性蛋白酶主要是由微生物发酵提取而得的，可用于各种蛋白质水解处理，水解产物为氨基酸、小肽等[1]。它是被最早发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、畜禽血液蛋白质水解、酒和饮料的澄清以及医药治疗等领域[2-5]。近年，也有应用于多肽制备、降解棉酚、破乳等的相关研究[6-9]。相对国外酶制剂活性来说，国产酶制剂活性很低，而酶制剂活性的提高，关键需要采用合适的技术手段来选育高产菌种。

诱变选育具有优良性状的微生物菌種是发酵工业的关键环节，而诱变方法的选择是菌种选育能否成功的关键[10]。其方法有多种，如物理诱变、化学诱变及基因工程育种等[11-13]。新型的常压室温等离子体（ARTP）诱变育种技术在具有操作简易、条件温和的基础上，可达到一次诱变便能获得2万个以上突变体的大库容高效诱变[14-15]。亚硝基胍（NTG）作为一种超强诱变剂，是公认效果显著的化学超诱变剂。该研究拟采用ARTP-NTG复合诱变技术处理对数生长期的中性蛋白酶菌液，筛选酶活提高的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），山东隆科特酶制剂有限公司菌种实验室保藏。

1.1.2 主要仪器与设备。

ARTP-IIS常压室温等离子体诱变系统（无锡思清源生物科技有限公司）;

ZXSD-A1270生化培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）;

ZWF-B3612摇瓶机（上海智诚分析仪器制造有限公司）;

5810R离心机（德国Eppendorf公司）;

Plus384酶标仪（美国MD公司）;

UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.1.3 试剂。

蛋白胨、酵母粉（美国BD公司）;

酵母膏、牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）;

葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化锌、琼脂粉、酪蛋白均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）;

玉米淀粉、豆饼粉、麸皮（市售）。

1.1.4 培养基。

1.1.4.1 分离筛选培养基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、氯化钠0.5%、酪蛋白1.00%、琼脂粉2.00%，pH 7.0。

1.1.4.2 种瓶培养基。蛋白胨1.00%、牛肉膏0.5%、酵母膏030%、葡萄糖1.00%、氯化钠0.2%，pH 7.0。

1.1.4.3 摇瓶培养基。玉米淀粉6.30%、豆饼粉2.00%、麸皮250%、Na2HPO4·12H2O 0.20%、KH2PO40.04%、ZnCl2 005%，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备。

采用常规稀释分离法将菌悬液适当稀释后，涂布于分离平皿，并于30 ℃培养24 h可长出菌落，能观察到生长菌周围有一透明圈，按透明圈和菌落直径比的大小挑选菌株，挑取直径比最大的单菌落接种到种瓶培养基中，于30 ℃条件下，200 r/min培养至对数生长期，得到待诱变的菌悬液。

1.2.2 菌种生长曲线的测定。

将菌种接入种瓶，于30 ℃培养，计时，每隔1 h取样3 mL，以未接种培养基作空白，用UV-1800紫外可见分光光度计在680 nm波长下测定样品的吸光度。以时间为横坐标，样品吸光度值为纵坐标绘制一条曲线即为菌体生长曲线。

1.2.3 ARTP诱变。

吸取10 μL菌悬液置于载片中央并涂抹均匀，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，调整照射距离2 mm，气流量10 L/min，功率100 W，进行诱变处理。将出发菌株分别照射0、5、10、15、20、25、30、35、40 s，将诱变后的菌悬液稀释不同梯度涂于酪蛋白再生平板，于37 ℃培养24 h，通过菌落数计算诱变菌株的致死率，并绘出致死率曲线。致死率计算公式如下：

致死率=（1-ab）×100%

式中，a为经ARTP系统处理后平板上的平均菌落数（CFU）;

b为未经ARTP系统处理平板上的菌落数（CFU）。

1.2.4 ARTP诱变菌株的筛选。

将诱变后的菌液涂布于筛选平板上，于37 ℃培养24 h，挑选酪蛋白水解圈直径与菌落直径比较大的菌株;将这些菌落接入种瓶培养基培养至对数生长期，然后将种液转入摇瓶培养基，培养结束采用国标法测定中性蛋白酶酶活，并挑选出酶活较高的菌株复筛验证。

1.2.5 NTG诱变。

将ARTP诱变处理之后的高产菌株接入种瓶培养基培养至对数生长期，其菌液经离心洗涤后，加入缓冲液重悬，按不同梯度于250 mL三角瓶中，分别加入重悬液、缓冲液、NTG溶液（NTG浓度取0.1～1.0 mg/mL），于30 ℃摇床中振荡处理不同时间，处理之后离心，倾去上清液，用缓冲液洗涤3次，最终得到的菌体加入一定浓度甘油，重悬，分装保存，以便后期使用。同时，取出不同梯度诱变种液稀释不同梯度涂于酪蛋白平板，计算诱变致死率，以备后期筛选。

1.2.6 NTG诱变菌株的筛选。

将诱变菌悬液适当稀释，涂布分离平皿，于37 ℃培養24 h，根据菌落形态及酪蛋白水解圈直径与菌落大小的比值，初步筛选菌株，然后经摇瓶发酵培养，测定酶活，筛选高产菌株。

1.2.7 高产菌株遗传稳定性验证。

对经NTG诱变处理之后筛选到的高产菌株进行连续传代试验，考察其遗传性状的稳定性。连续传代6代，每次传代后的菌株经摇瓶培养，测定其中性蛋白酶酶活。

1.3 酶活测定方法

按国标GB/T 23527—2009，采用Folin法测定中性蛋白酶酶活。中性蛋白酶酶活定义为1 g固体酶粉（或1 mL液体酶）在一定温度和pH条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。

2 结果与分析

2.1 出发菌株生长曲线的测定

菌体在对数生长期内，营养充足，生长迅速，代谢活性高，且此阶段细胞性质稳定统一，对理化因素较为敏感，易变异，重复性较好，所以一般选用处于该生长时期的细胞进行处理。由图1可知，培养后的4～10 h为菌体的对数生长期，10 h后进入稳定期。综合考虑细胞生物量等因素，选择培养7 h的菌体细胞进行诱变处理。

2.2 ARTP诱变的致死率曲线

按“1.2.3”进行处理，分析数据得到出发菌株的ARTP致死率曲线（图2）。随着处理时间的延长，ARTP致死率不断增大。依据中等诱变剂量容易筛到正突变菌株的原理，当照射时间达15 s时，菌株致死率达82%。因此，选择15 s作为菌株ARTP诱变的处理时间。

2.3 ARTP诱变筛选结果

通过对ARTP诱变突变株的筛选，筛选出5株透明圈与菌落直径比值较对照有所增大的菌株，分别进行摇瓶发酵，酶活检测，测定结果如表1所示。

由表1可知，突变菌株1-25摇瓶发酵酶活较对照酶活提高了40%，为摇瓶发酵水平最高的菌株，选用该菌株进行后续试验。

2.4 NTG诱变的致死率曲线

按“1.2.5”进行诱变处理，分析得到菌株1-25的NTG诱变的致死率曲线（图3）。随着处理时间的延长及NTG诱变剂量的增大，菌株致死率在不断增大。NTG浓度较低时，诱变效果不佳，浓度过高会影响菌落再生，不利于筛选。综合考虑再生率与正突变概率存在范围，后续试验在NTG浓度0.4 mg/mL，处理时间15～20 min的条件下进行。

2.5 NTG诱变筛选结果

对菌株1-25经NTG诱变后的种液进行平板分离，筛选（筛选菌落形态变化明显及透明圈与菌落直径比值较大的突变菌株），然后进行摇瓶发酵，酶活检测，结果筛选到7株较菌株1-25酶活明显的菌株，测定结果如表2所示。

由表2可知，经NTG诱变后，正突变菌株酶活提高明显，其中，菌株N-36较原始菌株A-06酶活提高了90%。

2.6 高产菌株遗传稳定性试验结果

作为生产菌株，其遗传稳定性对于稳定生产具有极其重要的作用。对突变菌株N-36进行连续6次传代试验，经摇瓶发酵培养，酶活检测，验证其遗传稳定性。

由表3可知，经连续6次传代，其摇瓶发酵酶活均在28 000 U/mL以上，相对酶活均在97%以上，结果表明突变菌株N-36具有良好的遗传稳定性。

3 结论

采用ARTP-亚硝基胍（NTG）复合诱变的方式对出发菌株枯草芽孢杆菌A-06进行遗传改造，经平板筛选，摇瓶发酵

培养，筛选到一株遗传稳定性良好的突变菌株N-36，其发酵

酶活力相对于出发菌株提高90%左右。試验结果表明，产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌通过ARTP-NTG复合诱变，其诱变效应大大提高，该研究为选育具有优良性状的微生物菌种提供了依据。

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