籼稻花药培养诱导条件优化
材料进行花药培养。采用正交试验法设置预处理温度、预处理时间、热激温度、噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）浓度4种因素各4个水平，共16种处理组合，对不同条件下花药诱导出愈率进行比较。结果表明，直观分析确定的4个因素最优组合为预处理温度10 ℃、预处理时间8 d、热激温度37 ℃、TDZ浓度0.10 mg/L，但考虑到因素间的交互作用，进一步分析得到最优组合为预处理温度10 ℃、预处理时间8 d、热激温度37 ℃、TDZ浓度0.05 mg/L。
关键词：籼稻;花药培养;诱导效率;交互作用
中图分类号：S511.2+1 文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2019）23-0218-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.054 開放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Optimization of induction conditions for anther culture of indica rice
LI San-he1，2，ZHA Wen-jun1，XU Hua-shan1，LIU Kai1，ZHOU Lei1，YOU Ai-qing1，2
（1.Food Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasms and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China;2.Collaborative Innovation Center of Hubei Province，The Main Food Crop Industrialization （Yangtze University），Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Anther culture was carried out with F1 generation of Fudao 88//Huazhan/Yuyou 2640 as material. The orthogonal test method was used to set four levels of pretreatment temperature， pretreatment time， heat shock temperature and concentration of thiazolidine（TDZ）; a total of 16 treatment combinations were used to induce anthers under different conditions. The anther induction rate was compared under different conditions. The results show that the optimal combination of the four factors determined by visual analysis is： pretreatment temperature 10 ℃， pretreatment time 8 d， heat shock temperature 37 ℃， TDZ concentration 0.10 mg/L. However， considering the interaction between the factors， the optimal combination was obtained： pretreatment temperature 10 ℃， pretreatment time 8 d， heat shock temperature 37 ℃， TDZ concentration 0.05 mg/L.
Key words： indica rice; anther culture; induction efficiency; interaction
自1968年日本Niizeki和Oono将花药培养技术应用于水稻第一次获得水稻花药培养单倍体植株以来，中国也于1975年利用花药培养育种技术第一次育成了粳稻品种单丰1号，此后花培技术在中国常规水稻育种中开始应用。由于花药培养诱导产生的单倍体通过染色体加倍可以在当代获得稳定的纯合二倍体，同时表现出双亲性状的各种重组类型，所以将花药培养与常规育种技术相结合，可以快速纯合有益基因，提高选择效率，缩短育种周期[1-5]，或者快速得到较大的DH群体或稳定的水稻材料用于开展水稻相关基础研究。
虽然水稻花培技术已经有几十年的历史，但受制于基因型和其他多方面因素的影响，该技术在粳稻上的应用已经相对比较成熟，但籼稻的花培效率一直较低，严重影响籼稻花培在育种和相关研究中的应用。关于如何提高花药培养的效率，国内外也有很多的文献报道，在基本培养基成分、植物生长调节剂种类和配比、低温预处理及相关过程性因素等对培养效率的影响方面作了大量的研究[6-16]，部分培养效率有所提高，但总的来说，效果都不是很稳定。这些文献报道的试验条件探讨基本都是针对单个或多个因素的独立研究[4，12-24]，没有考虑因素间的交互作用，因而导致改变基因型时培养效果有非常大的变化。本研究将通过正交试验法，分析低温预处理温度、预处理时间、噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）浓度及热激温度4个因素对花药培养诱导效率的影响，探讨籼稻花药培养诱导的最佳条件，提高花培诱导效率，为水稻育种提供更好的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 所用水稻材料为籼型育种材料福稻88//华占/甬优2640。
1.1.2 培养基 以N6为诱导培养的基本培养基：N6+KT 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+脯氨酸600 mg/L+麦芽糖50 mg/L+植物凝胶3.0 mg/L;并添加不同浓度的TDZ;培养基pH均为5.8。
1.2 方法
1.2.1 试验方案设计 采用正交试验法，设置了包括不同低温预处理温度、预处理时间、TDZ浓度及热激温度4因素4水平的正交方案共16种处理组合。具体见表1和表2。
1.2.2 幼穗取材、低温处理及花药接种 操作按文献常规[17]进行，每个处理接种10瓶，每瓶接种100个花药。接种后于28 ℃黑暗進行诱导培养。
1.2.3 统计方法 黑暗培养40 d后统计每瓶诱导的愈伤组织个数，计算平均值得出该试验类型的愈伤组织诱导率。
2 结果与分析
2.1 花药诱导效果的观察
花药培养一般用出愈率来评价愈伤组织诱导效果。花药诱导效果试验各个处理组合的平均出愈率观察结果见表3。
出愈率=（愈伤组织块数/接种花药数）×100%
2.2 不考察交互作用的直观分析
低温预处理主要用于改善水稻花粉的生理状态，减少培养过程中的褐化，提高花粉脱分化程度，使之转向孢子体发育，从而提高诱导效率。由表4预处理温度4个水平的出愈率平均值k大小变化可知，预处理温度在4～10 ℃范围内变化时，花药愈伤组织诱导率随温度升高而增加，试验中预处理温度为10 ℃时，花药诱导效率达到最优;预处理时间在8～15 d范围内变化时，花药出愈率随时间延长逐渐下降，因而预处理时间为8 d时，花药诱导效率最优。
高温热激处理能加快小孢子分裂，从而提高花药培养的愈伤组织诱导率。热激温度和热激时间长短都对热激效果有影响，一般认为热激24 h效果最好，不同的热激温度对花药生理生化性状的影响有所差异，从而导致每个水平的出愈率不同。由表4热激温度4个水平的出愈率平均值k大小变化可知，试验中热激温度变化对花药愈伤组织诱导效率的影响并不稳定，但37 ℃时，花药诱导效率最优，这可能与多个因素的协同影响有关。
TDZ是一种非常有效的人工合成植物生长调节剂，它具有生长素和细胞分裂素的活性，能够替代生长素和细胞分裂素促进体细胞胚胎发生[25]，所以诱导培养基中加入一定浓度的TDZ能影响花药的出愈率。从表4 TDZ浓度4个水平的出愈率平均值k大小可知，一定范围内，TDZ浓度升高，花药愈伤组织诱导效率在逐渐增加，添加量为0.10 mg/L时达到最高;继续增加TDZ浓度，花药出愈率反而下降。
综合4个因素在不同水平条件下的出愈率的总和K及其平均值k和极差R可以看出，影响出愈率的因素极差大小排序为预处理温度>热激温度>预处理时间>TDZ浓度（A>C>B>D），根据各因素各水平的平均值确定优水平分别为A4、B1、C4、D3，即预处理温度为10 ℃、预处理时间为8 d、热激温度为37 ℃、TDZ浓度为0.10 mg/L，进而选出优组合为A4B1C4D3。
2.3 考虑交互作用的结果分析
2.3.1 预处理温度和预处理时间 图1为预处理温度A与预处理时间B的交互作用折线图。假定A、B间有交互作用，那么它们不同水平间的交互作用折线应该会有明显相交的现象，反之折线应该是趋于平行的。由图1可以看出，预处理时间为12 d和15 d的两条折线在预处理温度为4 ℃和6 ℃处是平行的，预处理时间为8 d和12 d的两条折线在预处理温度为8 ℃和10 ℃处是平行的，虽然图中有部分折线平行，但仍有明显相交的地方，即预处理温度和预处理时间之间存在交互作用。
2.3.2 预处理温度和热激温度 同理，由图2可以看出，预处理温度和热激温度的交互作用折线图上的折线有明显相交，没有平行的部分，即预处理温度和热激温度存在交互作用。
2.3.3 预处理温度和TDZ浓度 由图3可以看出，TDZ浓度为0、0.05和0.50 mg/L的3条折线在预处理温度为4 ℃和6 ℃处是平行的，但是图上4条折线更多的还是有明显相交的地方，并没有完全平行，所以预处理温度和TDZ浓度存在较小的交互作用。
2.3.4 预处理时间和热激温度 由图4可以看出，图上4条折线有明显相交，所以预处理时间和热激温度之间是存在交互作用的。
2.3.5 预处理时间和TDZ浓度 由图5可以看出，TDZ浓度为0.05、0.10 mg/L的两条折线有部分平行，但是其他部分、与另外两条折线都有明显相交的部分，没有完全平行，所以预处理时间和TDZ浓度之间也存在交互作用。
2.3.6 热激温度和TDZ浓度 由图6可以看出，TDZ浓度为0.10和0.50 mg/L的两条折线有部分平行，但是其他部分、与另外两条折线都有明显相交的部分，没有完全平行，所以热激温度和TDZ浓度是存在交互作用的。
2.3.7 考虑交互作用的试验结果分析 由表5的几个因素极差大小可知，这些因素对该材料花药诱导愈伤组织影响效应的主次顺序是A、A×B、A×C、A×D、C、C×D、B、B×C、B×D、D，在不考虑因素间的交互作用时，根据数据分析选出的最优组合为A4B1C4D3。但该试验中，交互作用A×D比交互作用C×D对该材料出愈率的影响更大，而交互作用C×D又比交互作用B×D的影响更大，交互作用B×D比因素D的影响更大，所以按A、D各水平搭配的好坏确定D的优水平，经过比较可以得到，取A4D2时最好，从而可以确定优方案为A4B1C4D2，即预处理温度为10 ℃、预处理时间为8 d、热激温度为37 ℃、TDZ浓度为0.05 mg/L（I-13处理组合），这也是试验16种处理组合中出愈率最高的组合。这个结果也证明了本试验正交设计得出的结果正是考虑了各因素间的交互作用。
3 讨论
以每种处理组合的出愈率作为检测该籼稻材料在每种条件下的诱导效率，具有简便快捷的优点，可较快地选出最优组合。本试验采用正交法设置了预处理温度、预处理时间、热激温度、TDZ浓度4个因素4个水平共16种处理组合，统计每种处理组合的出愈率，得出了预处理温度10 ℃、预处理时间8 d、热激温度37 ℃、TDZ浓度0.05 mg/L的优方案，即正交设计的方案I-13，这也印证了正交设计的合理性。当然，各因素的各水平之间可能还存在着一个更精细的水平可以使花药愈伤组织诱导效率更高，这需要更进一步的试验，缩小因素水平范围。同时，此次试验确定了每两个因素之间具有交互作用，但关于它们之间的交互作用到底是正作用还是负作用还有待进一步的研究。
赵永英等[26]曾经研究过TDZ在小麦花培中的作用，结果表明它的作用和剂量与小麦基因型有关系，因而在有的材料中呈现负向调控作用在有的材料中又呈现出正向调控作用。本试验中，TDZ浓度对籼稻花培的调控作用是正向的，但浓度不同，调控程度不一样，会出现波动，若只考虑单因素的影响，浓度为0.10 mg/L时效果最好，但综合其他因素，TDZ的浓度以0.05 mg/L为宜。其他品种水稻花药培养效果是否也可以受TDZ浓度的影响有待继续研究。
孫杰等[15]在水稻花药培养适宜条件的相关研究中关于最适宜的预处理温度是8 ℃，但本试验的最适温度是10 ℃，结论有所差异，可能是因为材料不同或者是培养过程中受到了其他因素的影响，但也没有超出一般文献报道的8～10 ℃预处理有较好效果的范围。通过热激温度对花药培养愈伤组织诱导率影响的测定，发现在一定范围内花培诱导效率随着热激温度的升高而逐步增加，综合考虑多个因素也能得出相同的结论，即一般来说，37 ℃热激24 h能起到最好的效果。
总的来说，籼稻花药培养效率受基因型的影响最大，且籼稻比粳稻低很多，想要将该项技术广泛应用到水稻育种中，除了多方面探索各种影响因素的最佳条件外，创制高花培效率的种质作为育种中间材料也尤为重要。
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