一种简易检测6-磷酸葡萄糖的方法
摘要：6-磷酸葡萄糖（G6P）是多种代谢途径的关键中间产物，一种简易高效的G6P测定法建立将有利于深入了解其在有机体中的代谢状态。前期研究发现，基于离子排斥色谱柱Bio-Rad Aminex HPX-87H与示差折光检测器的高效液相色谱分析无法有效地将这一化合物与1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸区分开来。因而，拟建立一种简便、专一且灵敏，检测浓度范围为0.2～10 μmol/L的G6P的酶学荧光检测法。同时，我们以模式真核生物酵母为材料，对G6P的提取方法进行改进，以使样本的测定更加稳定。
关键词：6-磷酸葡萄糖;高效液相色谱;酶学荧光检测;酵母
中图分类号： Q532+.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）10-0209-04
6-磷酸葡萄糖（G6P）是细胞内一种常见的化合物，它由葡萄糖在己糖激酶的作用下生成，在细胞内主要参与3种代谢途径：（1）进入糖酵解途径，为生物合成提供细胞能量或碳骨架;（2）进入磷酸戊糖代谢途径，为细胞提供还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和核酸前体;（3）进入糖原合成途径，为糖原合成提供G1P（葡萄糖-1-磷酸）[1]。因此，G6P是生物代谢途径的一个关键节点，其含量会影响细胞活力。已有研究表明，在磷酸戊糖途径中，葡萄糖经葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的作用生成G6P，同时伴随着NADPH和中间产物的形成，它们在多种生物和非生物胁迫的应答反应中起着重要的作用[2]。
目前，提取动物细胞内G6P的方法有2种，分别为Antonio法[3]和Ritter法[4]，都是使用三乙醇胺溶液提取G6P。测定动物细胞内G6P的方法则有色谱法[5-7]、高效液相色谱法（HPLC）[8]和酶学法[9]。色谱法须要配备昂贵的色谱仪，如Nicolet公司的Magna-IR750傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR），APPLIED SYSTEMS公司的Durasampl IR衰减全反射附件（ATR）[10]。高效液相色谱法虽然可以测定代谢过程中大多数有机酸和糖，但是在试验过程中发现不能有效分离G6P、果糖-1，6-二磷酸、3-磷酸甘油酸。而酶学荧光定量法[11]通过放大检测信号，可以提高酶学测定的灵敏度[12-13]和准确性，与高效液相色谱相比，该方法更为有效、经济。 目前，在具有细胞壁的真核生物（诸如酵母与植物）中，测定G6P的酶学方法鲜有报道。细胞壁的存在很大程度上增加了G6P的提取难度。本研究试图以模式真核生物——酵母为材料，建立以6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶促反应[14]为基础的荧光定量法，用于测定细胞内G6P的含量。该方法通过硫辛酰胺脱氢酶作用，使G6PD的产物与刃天青进行反应生成荧光物质[15]，放大G6P信号，从而达到微量检测的目的。鉴于植物细胞与酵母均存在细胞壁，本研究建立的方法对植物体内G6P的测定也具有一定的指导借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料 Y10000型野生酿酒酵母（Saccharomyces cerevvisiae）BY4742，由笔者所在实验室保存。
1.1.2 供试试剂 刃天青（Sigma，R7017），三乙醇胺（Sigma，900257），6-磷酸葡萄糖-（Sigma，V900924），6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Sigma，A5885），硫辛酰胺脱氢酶（Sigma，D5540），烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（Sigma，NADP-RO），3-磷酸甘油酸（Sigma，P8871），果糖-1，6-二磷酸[生工生物工程（上海）股份有限公司，A60048-0025]，甲醇（Amethyst，116481），三氯甲烷（上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯），硫酸（西陇化工股份有限公司，分析纯）。
1.1.3 供试仪器 小型台式离心机（Eppendorf 5424），-80 ℃ 低温冰箱（Thermo Fisher Scientific TSE240V），-20 ℃ 低温箱（SANYO MDF-U539-C），多功能酶标仪（*synergyH1），高速冷冻离心机（*CF16RXⅡ），真空冷冻干燥机（D-37520），高效液相色谱仪（Agilent1200型）配RID检测器、Agilent色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司），离子排斥色谱柱（Bio-Rad Aminex HPX-87H）。
1.2 酵母细胞培养
在30 ℃条件下，将细胞置于缺尿嘧啶（URA）的固体葡萄糖SC培养基板上培养2 d左右，然后选取单菌落于3 mL液体半乳糖SC培养基中培养1 d。测定D600 nm后转接至 10 mL 液体半乳糖SC培养基中，D600 nm=0.05，培养约10 h左右，取D600 nm=1.00的菌液10 mL（细胞数约为2.0×108，干质量为 28 mg），5 000 g、离心5 min后弃上清，用预冷的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤并悬浮细胞，再转移至2 mL离心管中离心后弃上清，于-80 ℃保存。
1.3 提取方法
1.3.1 Antonio法 G6P的提取方法参照Antonio等的报道[3]，取细胞数为2.0×108（干质量为28 mg）左右的酵母细胞用1 mL PBS溶液洗涤2次，去上清，然后加入1 mL预冷的甲醇/三氯甲烷混合液（体积比为2 ∶ 1），混合后涡旋，于 -20 ℃ 静置2 h，加入 500 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine两性离子缓冲液，pH值为5.4），18 000 g、4 ℃离心 10 min，转移上层水相，用1 mL 50%甲醇溶液对三氯甲烷相进行再次提取。合并2次提取液，在高速冷冻离心机中干燥后于-80 ℃保存。
1.3.2 Ritter法 G6P的提取方法參照Ritter等的报道[4]，取细胞数为2.0×108（干质量为28 mg）左右的酵母细胞用 1 mL PBS溶液洗涤2次，去上清，加入600 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine两性离子缓冲液，pH值为5.4），超声波处理5 min，重复1次后转移至2 mL离心管中，加入600 μL三氯甲烷，涡旋振荡30～60 s，收集提取液约1 mL。最后，在真空离心干燥机中干燥后于-80 ℃保存。
1.3.3 Antonio改进法 在Antonio法的基础上进行改进，取细胞数为2.0×108（干质量为28 mg）左右的酵母细胞用 1 mL PBS溶液洗涤2次，去上清，加入200 μL预冷的甲醇/三氯甲烷混合液（体积比为2 ∶ 1），0.3 g酸洗过的玻璃珠（直径为0.2～0.4 mm）涡旋仪振荡6 min（30 s冰上，30 s涡旋交替），加入500 μL 50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine两性离子缓冲液，pH值为5.4），18 000 g，4 ℃ 离心10 min，转移上层水相，用1 mL 50%甲醇溶液对三氯甲烷相进行再次提取。合并2次提取液，加入等体积的ddH2O，于-80 ℃冷冻后转移至真空冷冻干燥机，干燥完全后于 -20 ℃ 保存。
1.3.4 Ritter改进法 在Ritter法的基础上进行改进，取细胞数为2.0×108（干质量为28 mg）左右的酵母细胞用1 mL PBS溶液洗涤2次，去上清，加入200 μL预冷的50%甲醇溶液（4 mmol/L tricine两性离子缓冲液，pH值为5.4），0.3 g酸洗过的玻璃珠（直径为0.2～0.4 mm）涡旋仪振荡6 min（30 s冰上，30 s涡旋交替），再次加入800 μL 50%甲醇溶液，1 mL三氯甲烷，混匀离心后取上层水相，18 000 g，4 ℃，离心 10 min。提取物中加入等体积的ddH2O，于-80 ℃冷冻后转移至真空冷冻干燥机，干燥完全后于-20 ℃保存。
1.4 G6P的荧光检测法
将提取物溶于50 μL ddH2O中，取10 μL样品或G6P的标准品（浓度依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0和10.0 μmol/L）于96孔板中，加入90 μL混合液：50 mmol/L的三乙醇胺（TEA）（pH值為7.6）、1.0 mmol/L MgCl2、100 μmol/L NADP+、10 μmol/L 刃天青、0.1 U/mL G6PD和0.2 U/mL硫辛酰胺脱氢酶。反应液在室温条件下静置30 min后，在激发光530 nm、荧光590 nm条件下进行检测，对照组以TEA替代G6PD，其余条件保持一致。对照组的荧光检测值为非G6P的干扰物质造成的荧光读数。
1.5 高效液相色谱检测法
1.5.1 色谱条件 离子排斥色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H型（300 mm×7.8 mm，9 μm），流动相为5 mmol/L H2SO4溶液，流量为0.6 mL/min，柱温为60 ℃，检测器为RID，进样体积为20 μL。
1.5.2 标准品及混合标准品溶液的配制 用超纯水分别配制浓度为1 g/L的1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和6-磷酸葡萄糖标准品以及混合标准品的储备溶液，然后按0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、32.0、64.0 mmol/L的浓度配制G6P标准溶液以确定其测定范围，接着按照“1.5.1”节中的色谱条件进行分析。
2 结果与分析
2.1 高效液相色谱法检测G6P的非专一性
HPLC常用于糖浓度的测定，在检测过程中，G6P标准品的保留时间和1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸极为接近。如图1所示，1 g/L 1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和 6-磷酸葡萄糖标准品的保留时间分别为 5.928、6.365、
6.210 min，峰面积分别为368 984、231 419、232 975 mAU·min，而混合样品中只出现1个保留时间，为6.115 min，峰面积为736 738 mAU·min（面积约为3种标准品面积之和）。HPLC难以有效区分以上3种物质，因此无法通过该方法测定细胞内G6P的浓度。
2.2 酶学荧光检测法的建立
酶学荧光检测法是通过放大酶学信号，以检测G6P的微量变化。如图2所示，游离态G6P在G6PD的作用下形成 6- 磷酸葡萄糖内酯，并将NADP+还原生成NADPH，而NADPH在硫辛酰胺脱氢酶的作用下可以与刃天青反应，生成荧光性物质。G6P浓度的计算公式如下：
G6P浓度=（试验值-背景值）-标准曲线的截距标准曲线的斜率×样品质量×稀释倍数。
其中，背景值（即没有加6-磷酸葡萄糖脱氢酶处理）代表样品中含有的游离态NADPH及其他干扰物质的含量;试验值（即加入6-磷酸葡萄糖脱氢酶处理）代表样品中G6P和干扰物质的含量。
利用标准品制作G6P标准曲线，试验重复2次，如图3所示，在0.2～10.0 μmol/L浓度范围内，G6P含量和反应产物的荧光强度呈线性关系，且标准误差值较低。为避免系统误差对试验结果的影响，每次测定G6P的含量时均重新制作标准曲线。使用HPLC测定G6P时，样品量至少为1 mL，检测浓度范围为0.4～32.0 mmol/L，而酶学荧光检测法只需 10 μL 的样品，检测的摩尔浓度范围为0.2～10.0 μmol/L。说明使用酶学荧光检测法测定G6P，灵敏度高，稳定性好，对待测样品中G6P的浓度要求低。
2.3 G6P提取方法的优化
Antonio法和Ritter法是目前已知可以提取细胞内G6P的2种方法[3-4]，其分别采用冻融和超声波处理方式来破碎动物细胞，但这2种方法均无法完全破碎酵母细胞，在浓缩提取液时，高速离心浓缩须持续离心24 h且效果不佳。为解决上述问题，在Antonio法和Ritter法的基础上本研究使用玻璃珠和冻干机进行细胞破碎和提取液冻干处理。如图4所示，在Antonio法和Ritter法的基础上进行改进，结果发现Antonio改进法与其他3种方法得到的G6P浓度存在极显著差异。已有文献报道，动物细胞内G6P含量约为 714 pmol/mg DW，Antonio法和Ritter法所测得的G6P浓度仅分别为211.8、264.9 pmol/mg DW，且标准误差大，这2种方法可行性较低[3]。Antonio改进法和Ritter改进法测得的G6P浓度分别为774.0、 365.8 pmol/mg DW。因此，使用Antonio改进法-酶学荧光定量检测法可有效测定酵母体内G6P的浓度。
经研究推测，Antonio改进法提取效率高的原因是（1）通过玻璃珠使酵母细胞破碎完全，可提高所测定的G6P浓度值，此方法也适用于含有细胞壁的植物细胞;（2）提取的过程中先加入三氯甲烷，可以破坏细胞膜引发细胞死亡，使细胞内的相关酶瞬间失活，从而减少了由G6P降解所引起的损耗;（3）通过真空冻干机对样品进行冷冻干燥处理，由于冷冻干燥机可以将温度维持在-20 ℃以下，以保证将所有样品冻干至粉末状，大大提高了提取效率。
3 结论
本试验在原有测定G6P方法的基础上进行适度改进，从而建立了适用于具有细胞壁细胞的提取方法。此方法亦可应用于植物细胞中，但由于植物细胞比酵母细胞结构更为复杂，还须要进一步试验以摸索并改善相关条件。该方法除了可用于测定G6P的含量，还可用于胞内NAD+和NADPH含量的测定。由于目前普遍使用试剂盒检测动物细胞内NAD+和NADPH的含量，但试剂盒法并不适用于大样本及植物细胞的测定，而使用Antonio改进法-酶学荧光定量检测法可以大大降低成本，并为进一步测定具有细胞壁的细胞体内NAD+和NADPH的浓度提供借鉴。
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