A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

摘 要：世界首个单克隆抗体 （Monoclonal antibody，简称单抗） 于1986 年， 获得美国食品与药品监督管理局的上市批准，拉开了单抗药物发展的序幕，成为生物医药领域中最耀眼的明珠。单克隆抗体纯化过程中A蛋白（Protein A）层析介质的选择尤为重要，可以影响抗体的纯度。本文主要阐述单抗纯化过程中A蛋白亲和层析的相关内容。

关键词：A蛋白；耐碱性；动态载量

全球医药行业走向趋势是精准医疗时代，单抗是其中较为成熟的领域，引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单 抗 药 物 主要是 由 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 （Chinese hamster ovary cell，简称 CHO 细胞） 表达产生，由 CHO 细胞分泌的外源蛋白分子，通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化，其产量已达5-10g/L，同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化，单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。

根据终产品纯度、杂质含量的严格要求，单抗目前采用三步纯化策略：粗纯 （样品捕获）、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的 50%-80%。用A蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤，一步纯化可使蛋白纯度达 95%以上。但A蛋白树脂价格昂贵，在大规模生产中，A蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的 35%以上。因此，蛋白 A 纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。

1 A蛋白的性质金黄色葡萄球菌

A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区域结合。天然的A蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的SPA 54KD，去掉与细胞壁结合部分的SPA 42KD。SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。近几年来基因工程的SPA出现，解决了天然A蛋白的耐碱性问题，MabSelect Sure是基因工程的SPA，去掉了天然SPA的DACE 区域，对于B区域进行了修饰，将不耐受NaOH的氨基酸去掉。使修饰后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH；这就很好的解决了层析介质CIP的问题，同时修饰后的SPA也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对SPA的作用，使洗脱收集液中SPA的脱落更低。

2 结合单抗的A蛋白层析介质的选择

在A蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是HCP和基因组DNA；由于A蛋白层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱pH，加入添加剂等；在此捕获步骤中会有A蛋白（配基）的脱落。在A蛋白捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基A蛋白，以及A蛋白与介质骨架的偶联方式，这些都是protein A的脱落原因，所以选择A蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。

2.1 A蛋白层析介质相关指标

耐碱性：药物GMP生产最基本的要求是无菌、无热源。NaOH 是最好的除菌、出热源的试剂。同时NaOH也是公认的CIP试剂，使用NaOH 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；幵且NaoH的成本低。NaOH是公认的CIP试剂，实验表明，NaOH的清洗效果高于其他试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（CPG）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。CPG填料在高pH下不稳定，不适合用NaOH清洗。传统的A蛋白的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，幵且在配置时浓度较高，这对生产是一个瓶颈。

GE公司的MabSelect Sure 系列是通过基因工程修饰的A蛋白介质，去除了不耐受NaOH的氨基酸，提高了层析介质耐受NaOH的能力。同时 MabSelect Sure LX是最新的A蛋白层析介质，结合了耐碱和高载量的性质。另外， Mabselect Sure和Mabselect Sure LX介质在NaoH清洗后寿命可以在300次以上。使用不同浓度的NaOH 清洗Mabselect Sure 的使用次数。随着抗体技术的发展，培养条件改善以及表达量的大幅度提高（生产规模已经到达3-5g/L），杂质的量（HCP）也随之提高[3]。如果不能将介质清洗干净，这会影响工艺以及产品的质量。在这种情况下使用高浓度的NaOH （0.5M）的非常必要的。

载量及保留时间：一般Protein A层析介质的理论载量为80g/L左右。高载量可以减少层析柱的体积。保留时间是指样品在层析柱内的停留时间或样品与层析介质的接触时间。较低的保留时间可以使用较快的流速，从而提高生产效率。

在抗体纯化工艺开发时，对于动态载量以及保留时间是一个平衡的过程，单纯追求高动态载量，可能保留时间会较长，使得上样时间延长，这样培养基中的蛋白酶就有时间分解样品，以及上样时蛋白酶降解A蛋白，使A蛋白的脱落增加。另外一些高载量的A蛋白层析介质，是通过提高配基密度增加动态载量的。但是配基密度提高过程中，如果配基与的层析基质（骨架）的偶联不稳定，就会增加A蛋白的脱落。此类A蛋白介质在初期动态载量较高，经过一段时间的使用，随着配基的脱落，载量很快降低。

單纯追求高流速，可能会使层析介质的柱压升高，提高了纯化过程中对生产设备（层析柱以及层析系统）的要求，从而增加层析柱以及层析系统的采购成本。随着上样次数的增多（生产循环次数的增加）层析介质的反压增加，从而减少层析介质的寿命。另外，有文献报道，以硅胶基质或CPG的在重复装柱的过程中易破碎，从而增加运行的压力以及影响介质的寿命。现代的A蛋白的动态载量一般在35-60g/L之间，保留时间一般在3-5min左右（20cm柱床高度，线性流速在250-400cm/h ）。

配基脱落率：配基脱落在单抗药物中有严格的规定，在最终的药物中protein A 的残留<10ppm。所以Protein A捕获步骤中，选择低protein A的脱落的层析介质对抗体药物质量控制以及工艺的风险控制是非常关键的。

非特异杂质吸附低：A蛋白捕获的样品是细胞培养的上清液。宿主蛋白是捕获步骤的主要杂质。虽然Protein A对抗体的Fc有特异性、专一性，但是层析介质的基质（骨架）有时会对杂质有非特异吸附。有文献报道以聚合物为基质的Protein A层析介质非特异吸附较高，洗脱时宿主蛋白会与抗体共同洗脱。从而HCP的殘留量较高。

层析介质压力/流速特性：在生产中层析介质的装柱是必不可少的一项工作。这与小规模实验室层析柱的使用是完全不同的。生产中使用的层析柱一般直径在300mm以上；有些剂量大的项目，生产中需要使用直径1-1.4m的层析柱。其装柱不只是层析柱的设计，层析介质的装柱方法是否适用，以及在装柱过程中层析介质是否易破碎时关键的因素。

商业规模的层析介质主要分为两种：层析介质的压力/流速曲线在放大过程中在层析介质的拆装过程中对于较硬的CPG骨架的介质容易破碎，从而进一步增加使用中的压力。以琼脂糖为骨架的层析介质，有一定的弹性。加之可以很好的清洗，所以在生产中可以保持很好的压力/流速曲线。

综上，在单克隆抗体的纯化工艺中Protein A的捕获步骤是十分重要的，选择耐碱性好、适宜载量、配基脱落率低等性质的层析介质，可以延长其使用寿命，并减少生产成本和风险。

参考文献

[1] Scott AM， Wolchok JD， Old LJ. Antibody therapy of cancer. Nat Rev Cancer， 2012， 12（4）： 278-287.

[2] 郭亚军. 基于单克隆抗体的肿瘤免疫疗法研究进展. 生物工程学报， 2015， 31（6）： 857–870.

[3] Guiochon G， Beaver LA. Separation science is the key to successful biopharmaceuticals. J Chromatogr A， 2011， 1218（49）： 8836–8858.

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