木质素过氧化酶对双酚A类化合物的分子动力学模拟

材料与方法

1.1 数据来源

试验中选取的9种化合物包括：2，2-双（4-羟基苯基）丙烷（简称BPA）、4，4-二羟基二苯基甲烷（简称BPF）、2，2′-二（4-羟基苯基）-六氟丙烷（简称BPAF）、2，2-双（2-羟基-5-联苯基）丙烷（简称BPQ）、2，2-二（4-羟基苯基）丁烷（简称BPB）、4，4′-（1-甲基亚乙基）双（2-甲基苯甲醚）（简称BPC）、4，4-二羟基二苯砜（简称BPS）、4，4′-亚乙基双苯酚（简称BPE）、4，4-（1-苯乙基）双酚（简称BPAP），其共同特点就是具有两个或多个芳环并共同连接到一个中心C上，各种化合物的结构式如图1所示。

1.2 计算及模拟方法

LiP在RCSB Protein Data Bank—RCSB PDB中有多种构型，本试验参照冯义平等[12]关于LiP催化去除水中雌激素的研究，选取酶晶体结构1B82，以此物质作为分子对接和动力学模拟的蛋白质受体。

LiP与双酚A类化合物的分子对接：分子结构进行能量最小化的优化（Tripos力场进行），采用最陡下降法-共轭梯度法[13]，设置能量收敛值为0.005 kJ/（mol·？魡），优化次数设置为1 000，最后进行加电荷并负载Gasteiger-Hückel电荷[14]。为了研究的简化，除去LiP（1B82.pdb）中两条完全对称的B链中的一条，为蛋白质加载电荷加氢，固定所有的氢原子。采用AMBER7 FF99力场对蛋白质进行修复和能量最小化优化。对接过程以CH4、C=O、N-H为分子探针，指定原型分子的探测方式为配体，阈值默认值为0.5，其他参数为默认值[15]，进行对接。对接之后找出对接效果最好或有代表性的物质进行分子动力学模拟。

SYBYL-X1.3软件中Total_Score为总的Surflex-Dock得分，其值愈大说明对接复合物越稳定[16]。基于选择小分子的原则，本试验中主要考虑以下两点：一是选取对接效果最好的进行模拟；二是从实际情况出发，双酚A普遍存在于自然环境中，而且双酚A类物质含量大大低于BPA，如何去除BPA的危害也将是今后研究的重点。本试验模拟将选取BPA和另外一种对接效果最好的小分子分别进行分子动力学模拟。

分子动力学模拟：体系模拟在Linux系统中的GROMACS[17]软件上进行。采用GROMOS96 43A1力场条件，定义晶胞和添加溶剂。模拟系统使用立方体水盒子，蛋白质与水盒子壁的最小距离为1 nm，并且加入了Na+，用以维持系统环境的性质为中性。用最陡下降法进行能量最小化，设置小分子化合物与蛋白质分子为同一整体，并进行系统平衡[18]。系统平衡包括正则系统NVT平衡和等温等压NPT平衡，两步平衡以保证完全平衡每个系统的性质[19]。最后，在水环境恒温300 K的系统平衡条件下，对试验进行了10 000步数动力学模拟。

2 结果与分析

2.1 分子对接结果分析

将LiP与双酚A类小分子化合物进行分子对接，得到的分子对接结果如图2所示，其结果数据见表1。由表1可知，BPQ的总值得分最高，说明其与Lip对接最牢固，与LiP的对接稳定性比其他双酚A类化合物好。由于BPA是双酚A类化合物的典型代表，而BPQ与LiP的对接得分最高，对接效果最好，所以选择BPA和BPQ进行模拟分析。

过氧化酶结合位点的结构特性对于其与底物的结合有重要意义。通过SYBYL软件，可以找出小分子化合物与LiP的结合位点，图3中BPQ、BPA活性位点处的氨基酸残基均为HIS39、MET172、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46。在距离LiP活性位点5 ？魡范围内的蛋白质结合位点的氨基酸残基有HIS39、PRO145、

GLU146、PRO147、GLU40、MET172、LEU173、SER174、ALA175、HIS176、ILE42、VAL178、ALA179、ALA180、ARG43、PHE193、ILE235、LEU44、SER237、PHE265、VAL45、PHE269、LEU272、PHE46和HIS47。

氢键在受体和配体的相互结合过程中发挥着重要作用，研究结合位点上的氨基酸与配体键的距离可以反映受体和配体之间是否发生相互作用。利用SYBYL软件还可以识别氢键连接的位点，即找到并生成氢键的供体和受体。图4显示小分子化合物BPQ、BPA通过氢键连接的氨基酸残基位点和小分子在酶腔体中的位置。从计算结果得知，当BPQ与LiP进行对接时，氢键与酶的3个氨基酸残基相连，它们分别是PRO83.O（id141）、ASP183.OD2（id470）和ASN182.HD21（id1221）；当BPA与LiP进行对接时，氢键与酶的2个氨基酸残基相连，分别是PRO83.O（id141）和ARG43.HH21（id818）。将二者进行比较可知，BPQ、BPA与LiP对接之间的氢键有一个共同的受体，那就是氨基酸残基PRO83.O（id141），说明该氨基酸残基在双酚A类化合物与LiP的反应过程中起着重要作用。在BPQ、BPA与LiP对接的过程中，不仅存在着氢键的作用，而且还存在着疏水力的作用。LiP活性位点附近亲水面和疏水面如图5所示。LiP活性位点附近的亲水面和疏水面分别作为氢的受体和供体的两个原子，如果二者在3.5 ？魡距离范围内，则可能存在亲水作用，如果蛋白质中的某个疏水集团抑制剂分子在6.5 ？魡距离内，则二者之间可能存在某种疏水相互作用。由表2中的作用原子键长可知，BPA和BPQ分别在蛋白质活性位点的空腔内形成亲水相互作用。

2.2 动力学模拟结果分析

分子动力学模拟是在水环境中完成，体系的温度为300 K，压力为1.018个大气压[20]。温度、压力及势能均达到收敛，说明分子动力学模拟正常。模拟过程中将配位蛋白质（LiP）相对于初始结构的均方根偏差RMSDs值作为衡量体系是否稳定的指标，即检查能量项的收敛情况[21]。在本试验中蛋白质复合物相对于初始结构的均方根偏差如图6所示。在10 000 ps的分子动力学模拟过程中，小分子BPA和BPQ对蛋白质的影响不同，未结合任何小分子的蛋白质在3 000 ps后基本趋于稳定，而结合了BPA的蛋白质复合体的RMSDs值波动明显，且在8 000 ps时呈上升趋势，这说明小分子BPA的结合增加了蛋白质柔性，而结合了BPQ的蛋白质复合体RMSDs表现与未配位蛋白RMSDs一致，说明了BPQ与酶结合更稳定，BPA比BPQ对LiP酶构象的诱导更显著。

酶和底物结合以后，不仅LiP的构象会改变，小分子的构象也会发生变化，这种变化使得底物更接近于过渡态，可以降低活化能。除了分析蛋白质结构的变化外，本试验同时分析了小分子配体BPQ、BPA在分子动力学模拟过程中结构的变化。图7为小分子配体相对于初始结构的均方根偏差（RMSDs）。BPQ的RMSDs值在0～3 000 ps时波动明显，3 000 ps之后则在0.275 nm周围稳定波动，说明BPQ在结合位点附近经历构象的改变；而BPA的RMSDs值在3 000～8 000 ps起伏变化较大，说明在酶催化反应中底物BPA经历了较多的构象选择；通过对比两种小分子配体RMSDs值可知，BPA比BPQ的上下波动更明显，说明BPA不容易与LiP形成稳定结构，在酶空腔中较难寻找到最适构象。

回旋半径用于度量结构的紧密度，其未配位蛋白质（LiP）骨架碳原子及其配位后蛋白碳骨架回旋半径（Rg）[22]如图8所示。BPQ体系和BPA体系的Rg不同程度变大，说明体系发生了膨胀。其中两个系统的Rg值变化趋势基本是相同的，说明未配位蛋白质、蛋白质与BPQ结合的复合物构象改变的影响是适度的；但是可以明显看出，酶在配位后，BPA的蛋白质的回旋半径变化范围比BPQ的大，证明BPQ对酶的结合更稳定，容易形成过渡态从而加快酶对BPA催化，而BPA对LiP有更多诱导。

三次蛋白质（LiP）骨架碳原子的基于残基分析的均方根波动（RMSFs）[23]分析如图9显示。由图9可以看出，无配体和有配体的复合物结构对部分残基的柔性的改变是一样。结果表明，蛋白质与小分子反应时氨基酸残基柔性发生改变，即小分子与氨基酸残基发生碰撞位点的变化。

BPA和BPQ经过10 000 ps的分子动力学模拟后，在6.5 ？魡之内与蛋白活性位点的相互作用力主要是疏水作用，其情况如图10所示（睫毛键表示疏水力）。由图10可以看出，6.5 ？魡距离内，BPQ与活性位点Val184、Glu146、His82、Ile85、Phe193、Arg43、Glu40、His39、Ala180、Asp183、Asn182、Val181、Pro145、Pro83、Pro147、His47总共16个氨基酸残基存在疏水作用；同样，BPA与Met172、Leu169、Val158、Glu146、His176、Ile154、Ile235、Ser237、Pre145、Pre147、His47、Leu173、Phe46共13个氨基酸残基也存在疏水作用。双酚A类小分子与LiP之间的非键相互作用有利于底物的代谢。

3 小结

通过分子对接和分子动力学模拟进行LiP与BPQ、BPA的相互作用研究，结果表明LiP催化降解BPAs的反应能够自发进行，小分子与酶之间通过氢键连接，BPQ、BPA与LiP的结合位点处的氨基酸残基为HIS39、MET172、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46。对接时小分子在蛋白质空腔内是亲水性质且呈现弯曲结构，在10 000 ps的分子动力学模拟过程后，BPQ和BPA在LiP活性位点疏水力发挥极大作用。由此可见，双酚A类化合物中疏水作用激活了LiP。另一方面，BPQ和BPA经历了较大的结构变化，底物分子BPA的结构变化更为明显，BPA引起的LiP结构的变化也比BPQ要大，可以看出LiP可能被小分子BPA的诱导比BPQ显著，并在此基础上蛋白质发挥了更进一步的催化代谢作用。因此，推测LiP与BPQ的结合能力比BPA强，但是BPA分子结构以及酶体积和形状的变化程度更大，BPA比BPQ在酶活性中心也会经历更多的催化代谢途径。

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