重组人gdnf在人乳腺肿瘤上皮细胞中表达的研究
摘要：为了在人乳腺肿瘤上皮细胞系中表达重组人胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体，用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞中，经G418抗性筛选8～10 d后，分离稳定表达红色荧光蛋白的转染细胞，PCR鉴定转基因细胞，用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞，RT-PCR和Western Blot检测重组人GDNF的表达分泌。结果表明：重组人GDNF乳腺上皮细胞特异表达载体被成功构建，转染Bcap-37细胞后，稳定整合到细胞染色体中，转基因细胞经激素诱导后能够表达分泌糖基化的 GDNF，为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。
关键词：人乳腺肿瘤上皮细胞系；生物反应器；胶质细胞源性神经营养因子；表达载体；帕金森病
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0016-04
收稿日期：2014-07-23
基金项目：国家自然科学基金（编号：31060304）；内蒙古高等学校科学研究项目（编号：NJ10184） 。
作者简介：张学明（1970—），男，内蒙古包头人，博士，副教授，主要研究方向为重组药物蛋白。E-mail：byzhxm@126.com。帕金森病（Parkinsons disease，PD）是老年人群中常见的一种神经元退行性疾病，其临床表现主要是以静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势平衡障碍为特征。PD的病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元退行性丧失，导致纹状体中多巴胺含量显著降低[1]。目前用于PD临床治疗的常规药物主要有复方左旋多巴、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物等，这些药物能够暂时减轻或缓解症状，但不能阻止PD的进程，且长期用于PD治疗会出现多种并发症[2]；因而，研制开发新的药物用于PD的有效治疗是非常必要的。
胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-direved neurotrophic factor，GDNF）是由Lin等于1993年在B49神经胶质瘤细胞中分离纯化出的一种分泌性糖蛋白，属于TGF-β超家族成员[3]。研究表明，GDNF对多巴胺能神经元具有营养及保护作用[4]，应用GDNF治疗帕金森病已进入二期临床研究[5]。然而由于GDNF在人和动物体中含量低，从动物组织中分离纯化GDNF用于疾病动物模型和临床实验研究是不现实的；因而，应用转基因技术大量生产重组GDNF用于疾病动物模型和临床研究具有潜在的重大社会效益和经济效益。
本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的人GDNF基因乳腺上皮细胞高效特异表达载体，转染人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞，获得了能够表达重组人GDNF蛋白的转基因Bcap-37细胞系，为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白，并将其用于帕金森病临床治疗的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
大肠杆菌DH5α、pP40R、pCMV-Red、pUC-gdnf为内蒙古科技大学包头医学院医学生物化学实验室保存。
质粒提取试剂盒（QIAGEN公司）、小量RNA提取试剂盒（上海舜华生物工程有限公司）、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）、DNA纯化试剂盒（TIANGEN公司）。
Taq Plus、Pfu DNA聚合酶购自TIANGEN公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、M-MLV反转录酶、Oligo（dt）、限制性内切酶均为TaKaRa产品。
人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37购自中国科学院上海细胞研究所；RPMI-1640、催乳素、氢化可的松、胰岛素购自Sigma 公司；兔抗人多克隆GDNF抗体（Rabbit Polyclonal GDNF Antibody）购自Santa Cruz公司；连接了碱性磷酸酶的羊抗兔二抗（Goat Anti-rabbit Second Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase）及 BCIP/NBT 试剂盒购自博士德公司。
1.2试验方法
1.2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的构建根据Bonsing等发表的牛β-casein基因序列（M55188）[6]设计PCR上游引物：5′-TCTGGGCCCGAAAAGGGAAATGTTGAATGGGAAG-3′，下游引物：5′-GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3′，上下游引物两端分别引入ApaⅠ和XhoⅠ 酶切位点。提取牛基因组DNA，PCR扩增牛β-casein基因5′端上游包括启动子、第1外显子、第1内含子及部分第2外显子的3.6 kb调控序列，经ApaⅠ/XhoⅠ双酶切后插入到骨架载体pP40R[7]的ApaⅠ/XhoⅠ双酶切位点作为gdnf cDNA乳腺特异表达的调控序列。XhoⅠ 酶切质粒pUC-gdnf获得人gdnf cDNA基因插入到牛β-casein基因5′端3.6 kb调控序列下游的XhoⅠ位点。PCR检测gdnf cDNA的插入方向，PCR上游引物设计在载体3.6 kb调控序列上，引物序列为5′-ACTATTTCCTCATCTTCCCATTCCCAG-3′，下游引物设计在gdnf cDNA序列上，引物序列为5′-GAGCTCCAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反应条件：94 ℃变性45 s，62 ℃复性45 s，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环。正向插入将获得598 bp的特异产物，反向插入则无特异性PCR产物。载体构建完成后，对载体与片段连接处、牛β-casein基因5′端调控序列核心区域进行测序。
1.2.2Bcap-37细胞的稳定转染与筛选用含20%胎牛血清（fetal calf serum，FBS） 的RPMI-1640培养液，于37 ℃、5%濃度、饱和湿度条件下培养B-cap37细胞至70%～80%汇合时，消化细胞，以3×105个细胞/孔接种于6孔板。24 h后，按照脂质体Lipofectamine操作说明，每孔加入2.0 μg 线性化载体DNA转染细胞。48 h后，消化每孔细胞接种于 100 mm 培养皿中，并加入浓度为300 μg/mL 的G418筛选8～10 d后，将表达红色荧光蛋白的细胞克隆分离、扩培、冷冻保存备用。
1.2.3PCR检测稳定转染细胞提取稳定转染细胞基因组DNA，PCR检测 gdnf cDNA是否整合到细胞基因组DNA中。PCR 上游引物：5′-GACCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3′，下游引物：5′-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反应条件为：94 ℃变性45 s，58 ℃ 复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。
1.2.4转基因细胞的诱导表达阳性转基因细胞生长至80%汇合时，更换诱导培养基（RPMI-1640+4 μg/mL催乳素+10 μg/mL胰岛素+1 μg/mL氢化可的松），分别诱导培养24、48 h 后，收集细胞及细胞培养上清液。
1.2.5RT-PCR分析gdnf的表达诱导培养的细胞按照RNA提取试剂盒操作说明提取RNA，以1.0 μg RNA为模板反转录合成cDNA第1链。以cDNA为模板PCR检测转基因细胞诱导培养后是否有 gdnf 在mRNA水平的表达。PCR引物、反应条件同“1.2.3”节。
1.2.6Western Blot 检测 gdnf 的表达三氯乙酸法浓缩细胞诱导培养上清液，Lorry法测定蛋白浓度。取40 μg 蛋白，12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封膜，一抗4 ℃过夜杂交，二抗室温孵育1 h，BCIP/NBT显色。
2结果与分析
2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的鉴定
载体物理图谱见图1，PCR检测目的基因gdnf的插入方向见图2。酶切鉴定gdnf 插入方向正确的载体，用ApaⅠ单酶切载体后，线性载体大小与预期大小（11 507 bp）相符；用XhoⅠ酶切载体能够获得预期的576 bp的目的基因 gdnf 片段；用ApaⅠ/XhoⅠ双酶切载体能够获得预期的3.6 kb调控序列片段和576 bp目的基因gdnf 片段（图3）。载体与片段连接处、牛β-casein基因5′端调控序列核心区域的测序结果正确（数据未显示）。结果表明，本研究成功构建了以neo基因和DsRed2作为双筛选因子、牛β-casein基因5′端调控序列驱动的重组人 gdnf 乳腺特异表达载体。
2.2转基因细胞的鉴定
线性化载体转染B-cap37细胞，G418筛选8～10 d 后，获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆（图4）。分离扩培红色荧光细胞，提取基因组DNA，PCR扩增重组人gdnf，发现未转染细胞无特异条带，而稳定转染的红荧光细胞获得了与预期一致的特异条带（图5），表明重组人gdnf已整合到细胞基因组之中。
2.3gdnf 基因的诱导表达
2.3.1RT-PCR检测阳性转基因细胞及未转染细胞诱导培养24、48h后提取RNA，以RNA为模板PCR扩增 gdnf cDNA，无特异条带产生，表明RNA未受基因组DNA污染；以RNA为模板反转录合成cDNA第1链，PCR扩增 gdnf cDNA基因，诱导培养24、48 h的转基因细胞获得了558 bp特异条带，而阴性对照无特异条带产生（图6）。结果表明牛β-casein基因启动子能够驱动gdnf cDNA基因转录为mRNA。
2.3.2Western Blot检测诱导培养48 h的转基因细胞上清液经Western Blot探测，有大约15、18 ku 的2条特异带形成，而未转染细胞无特异带形成（图7），表明 gdnf cDNA基因能够翻译成蛋白，而且能进行翻译后加工形成糖蛋白分泌到细胞外。
3结论与讨论
当前，用于疾病动物模型和临床研究的重组人GDNF是用转基因大肠杆菌发酵制备的[8]。用大肠杆菌生产的重组人GDNF不能被糖基化[8]。临床研究表明，糖基虽然对GDNF的神经营养功能不是必要的，但在帕金森病Ⅱ期临床研究中，约有10%的病人由于重组人GDNF缺乏糖基化而产生了抗GDNF抗体的免疫反应[9]；因而，利用大肠杆菌生产重组蛋白虽然快速经济，但该表达系统由于缺乏翻译后修饰功能，而不适用于需要进行翻译后修饰的重组蛋白的生产。而且，已有研究表明利用大肠杆菌生产的重组人GDNF由于蛋
白质的错误折叠而影响了其生物学功能[10]。也有研究者用昆虫细胞和酵母菌制备重组人GDNF，这些低等真核细胞虽然可以表达糖基化的重组人GDNF，但其糖基化与天然的人GDNF的糖基化有差异[11-13]，从而在临床研究中同样存在安全问题。
当前，需要进行翻译后修饰的重组蛋白大多用非人类的哺乳动物细胞进行表达[14]。用非人类的哺乳动物细胞可以表达与天然人蛋白结构一致的重组人蛋白，但也有时候存在差异[15]；因而在治疗应用上，人们更希望利用人细胞系来生产与天然人蛋白结构完全一致的重组人蛋白[16]。
本研究将人gdnf cDNA插入到3.6 kb牛β-casein基因5′端调控序列下游，并用SV40 polyA序列作为其转录终止信号，构建了重组人 gdnf 乳腺特异表达载体。将其转入人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37中，获得了随机整合转基因细胞，用激素诱导表达后在细胞上清液中检测到了重组人GDNF蛋白。人GDNF蛋白为同源二聚体糖蛋白，单体糖蛋白18 ku，去糖基化单体约15 ku[17]。本研究从激素诱导的转基因细胞上清液中通过Western Blot 探测到约15、18 ku的2条特异条带，且重组人GDNF蛋白绝大部分为糖基化蛋白（图7）。由于该重组蛋白是用人乳腺肿瘤细胞系作为反应器制备的，因而，我们推测在人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37中表达的18 ku重组人GDNF蛋白与天然的人GDNF相比，在结构上应当没有差异，如果用于临床研究应当更具有安全性。本研究为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。
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