产油酵母菌高产培养基的营养成分优化
摘要：以产油酵母菌Y1为供试菌株，通过单因素及正交试验对其产脂发酵培养基进行优化。结果表明，最优培养基组成为葡萄糖85 g/L、蛋白胨40 g/L、（NH4）2SO4 10.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.300 g/L、Na2HPO4 3.0 g/L、 KH2PO4 2.5 g/L。按照营养成分最优组合，100 mL三角瓶装液量30 mL，液体种子接种量10%，摇床转速160 r/min，温度28 ℃，得到的产油酵母菌Y1生物量为20.25 g/L，生物量比优化前提高了46.5%。
关键词：产油酵母；营养成分；产脂；发酵；优化
中图分类号：S963.32+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5832-04
我国人均石化资源贮量十分有限，而能源需求量却与日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潜在油源。由微生物生产富含多种生理功能的不饱和脂肪酸油脂已引起国内外的广泛重视。因此，微生物油脂的研究将成为新世纪油脂工业的一个发展方向[1-3]。微生物油脂，又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌和细菌等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的油脂[4]。自然界中一些产油微生物在碳源充足而其他营养成分（通常为氮源）缺乏的情况下，可以在胞内大量积累油脂，甚至达到自身干重的60%以上[5]。产油真菌积累油脂过程中可在胞内形成一个或多个油脂颗粒[5-7]。与传统油脂生产相比，微生物油脂生产有许多优点，可连续规模化生产，周期短，所需原料丰富、价格便宜，并可利用工农业废弃物；且不受季节、气候变化限制，可利用细胞诱变、融合及基因工程等技术改良菌种等[8]。
本研究考察了不同碳源、氮源、营养盐对产油酵母菌Y1细胞生长的影响，通过单因素及正交试验进行高产培养基优化研究，为产油酵母产脂发酵生产基本配方提供参照，以期为合理利用廉价原料及大规模发酵生产微生物油脂奠定基础[9]。
1 材料方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 产油酵母菌Y1：包头师范学院生物科学与技术学院实验中心保存。试验于2012年3—4月在包头师范学院生物科学与技术学院微生物实验室完成。
1.1.2 培养基和试剂 液体种子培养基：20 g/L葡萄糖、5 g/L （NH4）2SO4、1 g/L KH2PO4、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L MgSO4·7H2O。
基础发酵产脂培养基：30 g/L葡萄糖、1.5 g/L蛋白胨、2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L （NH4）2SO4。
1.2 方法
1.2.1 发酵产脂培养基最适碳源和氮源 选择葡萄糖作为发酵产脂培养基的碳源，最适浓度为 85 g/L[10]，后续试验用此浓度作为葡萄糖基础浓度。
牛肉膏[10]为发酵产脂培养基的最适氮源，但考虑到牛肉膏成本较高、保存稍有不当极易染菌，所以选取获得菌体生物量稍低于牛肉膏蛋白胨作为后续试验的氮源。
1.2.2 产油酵母菌Y1种子液的培养[11] 取活化后斜面产油酵母菌Y1一环，接种于500 mL液体种子培养基中，28 ℃，180 r/min培养14 h，备用。
1.2.3 产油酵母菌Y1发酵产脂培养基最适氮源浓度测定 将发酵产脂培养基中蛋白胨浓度分别调整为3、5、8、12、17、23、30 g/L，其他成分不变，以10%接种量接入培养14 h的液体种子，160 r/min，28 ℃恒温振荡培养，在培养14～32 h之间每隔2 h取样测定发酵产脂培养液的OD600，然后以蛋白胨浓度为横坐标，以每个蛋白胨浓度中所测得OD600为纵坐标，绘制曲线图。
1.2.4 产油酵母菌Y1发酵产脂培养基的营养盐最适浓度测定 将发酵产脂培养基中营养盐浓度分别调整为表1中所示浓度，进行单因素优化试验，其他成分不变（碳源和氮源分别以所测得最适浓度作为后续试验的基准浓度），以10%接种量接入已培养14 h的液体种子，160 r/min，28 ℃恒温振荡培养，在培养14～32 h期间，每隔2 h取样测定发酵产脂培养液OD600，然后以不同营养盐浓度为横坐标，以在每种营养盐浓度中所测得的平均OD600为纵坐标，绘制曲线图[12]。
1.2.5 产油酵母菌Y1发酵产脂培养基营养成分正交试验 将单因素试验中得到的发酵产脂培养基各营养成分最适浓度作为正交试验各因素浓度水平中间值，建立L25（56）正交试验[13]。以10%接种量接入已培养14 h的液体种子，160 r/min，28 ℃恒温振荡培养，在培养14～32 h期间，每隔2 h取样测定发酵产脂培养液OD600。
2 结果与分析
2.1 产油酵母菌Y1发酵产脂培养基最适氮源浓度
氮源可促进细胞生长，在严重缺氮的条件下可观察到细胞内脂类的积累。无机氮有利于不饱和脂肪酸的产生，有机氮有利于细胞增殖[14]。以蛋白胨浓度为横坐标，以每个蛋白胨浓度的OD600为纵坐标绘制曲线图，如图1所示。由图1可知，在蛋白胨浓度为30 g/L时，OD600达到峰值。说明以葡萄糖作为最适碳源且浓度为85 g/L时，蛋白胨的最适浓度为30 g/L。
2.2 产油酵母菌Y1发酵产脂培养基最适营养盐浓度
以发酵产脂培养基不同营养盐的浓度作为横坐标，以发酵产脂培养液OD600为纵坐标绘制曲线图，如图2～5所示。
在葡萄糖浓度为85 g/L，蛋白胨浓度为30 g/L时，（NH4）2SO4在细胞中可作为氮源的适当补充，并为细胞提供相应的微量元素。由图2可以看出，在（NH4）2SO4浓度为16 g/L时，OD600达到峰值，说明其最适浓度为16 g/L。
MgSO4·7H2O是酶的激活剂，适量的浓度可以促进菌体生长[15]。由图3可知，MgSO4·7H2O的最适浓度为0.1 g/L。Na2HPO4、KH2PO4可以维持细胞的渗透压[15]，由图4、图5可知，二者的最适浓度分别为3 g/L和2 g/L。
2.3 产油酵母菌Y1发酵产脂培养基营养成分的正交试验结果
分别以葡萄糖浓度85 g/L，蛋白胨浓度30 g/L，（NH4）2SO4浓度16 g/L，MgSO4·7H2O浓度0.1 g/L，Na2HPO4浓度3 g/L，KH2PO4浓度2 g/L作为正交试验中各因素浓度水平中间值，进行正交试验，各因素和水平见表2。发酵产脂培养液OD600见表3。
由表3可知，各因素影响大小的顺序为蛋白胨、MgSO4·7H2O、葡萄糖、Na2HPO4、（NH4）2SO4、KH2PO4，其中对产油酵母菌Y1的OD600影响最大的是蛋白胨，MgSO4·7H2O、葡萄糖、Na2HPO4对OD600的影响居中且影响力较接近，（NH4）2SO4、KH2PO4对OD600的影响最小。正交试验得到最优营养成分组合为A4B4C1D5E3F4。
根据产油酵母菌Y1发酵产脂培养基最佳营养成分组合A4B4C1D5E3F4进行验证试验，测得培养时间为22 h时，发酵产脂培养基培养液OD600为1.031，优化前培养液OD600为0.761。离心分离并洗涤得到酵母，测得发酵产脂培养基培养的菌体湿重为44.63 g/L，优化前湿重为37.12 g/L。60 ℃烘干至恒重，测得由发酵产脂培养基培养的菌体干重为20.25 g/L，优化前菌体干重为13.82 g/L，比优化前提高了46.5%。由于在同等条件下，菌体干重（生物量）与油脂产量呈正相关，优化后的发酵产脂培养基有助于提供产油酵母菌菌体干重，即可提供菌体油脂产量。
3 小结
产油酵母菌Y1发酵产脂培养基营养成分最优组合为：葡萄糖85 g/L，蛋白胨40 g/L，（NH4）2SO4 10.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.300 g/L，Na2HPO4 3.0 g/L，KH2PO4 2.5 g/L。按照营养成分最优组合，100 mL三角瓶装液量30 mL，接种量10%，摇床转速160 r/min，温度28 ℃，得到的产油酵母菌Y1生物量为20.25 g/L，优化后生物量比优化前提高了46.5%，表明该营养成分优化结果合理、可行，为产油酵母菌的利用提供参考。
参考文献：
[1] 薛飞燕，张 栩，谭天伟.微生物油脂的研究进展及展望[J].生物加工过程，2005（1）：23-27.
[2] 赵宗保，华艳艳，刘 波.中国如何突破生物柴油产业的原料瓶颈[J].中国生物工程杂志，2005，25（11）：1-6.
[3] 咸 漠，甄 明，康亦兼，等.深黄被孢霉生物转化十六醇合成油脂的研究[J].高等学校化学学报，2000（7）：1108-1109.
[4] 邢大辉，潘安龙，薛冬桦，等.深黄被孢霉利用不同碳源产油脂比较[J].生物工程学报，2010，26（2）：189-193.
[5] MENG X，YANG J M，XU X，et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms[J].Renew Energ，2009，34（1）：1-5.
[6] KAMISAKA Y，NODA N，SAKAI T，et al.Lipid bodies and lipid body formation in an oleaginous fungus， Mortierella ramanniana var.angulispora[J]. Biochim Biophys Acta，1999，1438（2）：185-198.
[7] MURPHY D J， VANCE J. Mechanisms of lipid body formation[J]. Trends Biochem Sci，1999，24（3）：109-115.
[8] 薛飞燕，张 栩，谭天伟.微生物油脂的研究进展及展望[J].生物加工过程，2005，3（1）：23-27.
[9] 陈 合，余建军，舒国伟，等. 产朊假丝酵母1807高产培养基的优化[J].中国调味品，2010，7（35）：52-54.
[10] 马 勇，门中华.一株产油酵母菌高产培养基的碳源和氮源选择[J].安徽农业科学，2011，39（14）：8202-8203.
[11] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M]. 第三版.北京：高等教育出版社，1999.
[12] 童一中. 生物统计法[M].长沙：湖南科学技术出版社，1986.
[13] 夏伯忠. 正交试验法[M].长春：吉林人民出版社，1985.
[14] 徐华顺，罗玉萍，李思光，等.微生物发酵产油脂的研究进展[J].中国油脂，1999，24（2）：34-37.
[15] 吴开云，耿青伟，李纪元，等. 斯达氏油脂酵母高产油发酵培养条件的优化[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2011（2）：150-156.
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