营养条件对三角褐指藻生长和油脂积累的影响

摘要：研究了培养基中添加乙酸钠、尿素以及Ｆｅ３＋对三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）生长和油脂积累的影响。结果表明，培养基中添加乙酸钠作为碳源的兼养生长模式对三角褐指藻的生长和油脂含量的增加有明显的促进作用（Ｐ＜０．０５），在乙酸钠浓度为５．０ ｇ／Ｌ时得到最大生物量为１．２８ ｇ／Ｌ，是对照的１．７倍；而在乙酸钠浓度为０．５ ｇ／Ｌ时油脂含量达到最大（２８．９０％），是对照的１．９倍；培养基中添加适当浓度的尿素作为氮源，可以显著地提高三角褐指藻的生长速率（Ｐ＜０．０５），但对生物量和油脂含量没有显著影响（Ｐ＞０．０５）；培养基中Ｆｅ３＋浓度的增加对三角褐指藻的生长速率、生物量及油脂积累均没有显著影响（Ｐ＞０．０５）。

关键词：三角褐指藻；乙酸钠；尿素；Ｆｅ３＋；生物量；比生长速率；油脂积累

中图分类号：Ｑ９４９．２７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2292-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｏｉｌ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ

ＦＵ Ｒｕ１，２，ＨＵＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｇａｎ２，ＷＡＮＧ Ｈａｉ－ｙｉｎｇ１

（１． Ｋｅｙ Ｌａｂ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｓｏｕｔｈ－ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７４，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ａｄｄｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ｕｒｅａ ａｎｄ Ｆｅ３＋． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｓ ａ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｍｉｕｍ ｂｉｏｍａｓｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｓ １．２８ ｇ／Ｌ ｗｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ５．０ ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ １．７ ｔｉｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ２８．９０％ ｗｉｔｈ ０．５ ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ， ａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ １．９ ｔｉｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｕｒｅａ ａｓ ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ（P＜0.05）， ｂｕｔ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｃｈａｎｇｅｄ（P＞0.05）． Ｔｈｅｒｅ waｓ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ， ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ ｂｙ ａｄｄing Ｆｅ３＋ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ； ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ； ｕｒｅａ； Ｆｅ３＋； ｂｉｏｍａｓｓ； specific ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ； ｏｉｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ

由于全球经济一体化的不断发展，对化石能源的需求和消耗迅猛增长，因此发展替代能源是保障能源安全和自然平衡的重大战略举措。藻类具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高的特点，是生产生物质能的潜在资源，成为当今国内外的研究热点［１］。

通过改变培养基中的化学成分来控制微藻的新陈代谢从而提高微藻的生物量和油脂含量是当今研究的热点之一，但这类研究多集中于小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）［１］。三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）在分类学上隶属于硅藻门，油脂含量可达干重的１５．６％～３１．５％，因富含多不饱和脂肪酸（Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ＰＵＦＡ）而被广泛地应用于水产饵料，是一种极有开发潜力的优质经济藻种。对于三角褐指藻的生长条件和培养基中营养盐成分对其影响的研究，主要集中在对油脂中多不饱和脂肪酸组成的改变和生长调控方面，通过提高藻油中ＰＵＦＡ所占比例以提高其营养价值［２］。但对于通过调整培养基同步提高三角褐指藻的生物量和油脂含量的研究尚不多见，提高油脂产率的培养条件还不明确。王付冬等［３］和夏金兰等［４］分别探讨了不同Ｆｅ３＋浓度和光照条件对三角褐指藻生长、总脂含量的影响，这些研究结果显示，通过改变生长条件可以调控三角褐指藻的脂类物质积累。

藻的培养主要是进行光合自养，加入有机碳源的兼养培养方式被认为是一种可以实现藻的高密度生长的方式，但兼养模式下三角褐指藻油脂积累的研究还很少。为探讨培养基成分对三角褐指藻生长和富集油脂的影响，本研究采用水产饵料生产中常用的硅藻培养液，考察了添加乙酸钠、尿素及Ｆｅ３＋对三角褐指藻生长和油脂积累的影响，为三角褐指藻用于生物质能开发提供有价值的参考。

１材料与方法

１．１藻种

三角褐指藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）来自中南民族大学生命科学学院发酵工程实验室，经抗生素法制备无菌藻株。

１．２培养基

基础培养基配方由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，成分如下：ＮａＮＯ３ ０．０５ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ／Ｌ，１％的柠檬酸铁溶液０．１ ｍＬ／Ｌ，尿素０．０５ ｇ／Ｌ，维生素Ｂ１２ ２×１０－７ ｇ／Ｌ，维生素Ｂ１ ２×１０－７ ｇ／Ｌ，土壤提取液２０ ｍＬ／Ｌ，人工海水定容至１ ０００ ｍＬ，盐度为2.5%（质量浓度）。按照试验设计分别加入不同浓度的乙酸钠、尿素和ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ，均为分析纯。

１．３试验方法

分别进行碳源、氮源和铁盐的影响试验，每个浓度做３个平行。以基础培养基作为对照，选取乙酸钠为碳源，设置０．５、１．０、２．０、５．０ ｇ／Ｌ ４个浓度梯度进行碳源影响试验。以没有添加尿素和硝酸钠的基础培养基作为对照，以尿素为氮源，设置６０．１、１２６．１、２３４．２、４８０．５ ｍｇ／Ｌ ４个浓度梯度进行氮源影响试验。以没有添加柠檬酸铁盐的基础培养基作为对照，选取ＦｅＣｌ３·6H2O替代柠檬酸铁作为铁盐，设置３．２、６．３、９．５、１９．０、３４．７ ｍｇ／Ｌ ５个浓度梯度进行铁盐影响试验。培养温度为（２０±１）℃，光照强度为３ ５００ ｌｘ，光暗比为１２Ｌ∶１２Ｄ，静置培养，每天摇藻并随机更换三角瓶位置，以避免光照不匀，培养时间为１４ ｄ。

１．４比生长速率的测定

μ＝（ｌｎＮ２－ｌｎＮ１）／（ｔ２－ｔ１），其中μ为比生长速率（ｄ－１），ｔ为生长时间（ｄ），Ｎ２和Ｎ１分别是三角褐指藻在ｔ２和ｔ１时刻的生物量（ｇ／Ｌ）。

１．５生物量的测定

从接种当天开始，隔天取藻液测定５４０ ｎｍ处的光密度。根据标准曲线回归公式ｙ＝０．３９２Ａ－０．００９ （ｒ＝０．９９７ ８）换算成生物量，其中，ｙ为生物量（ｇ／Ｌ），Ａ为光密度。

１．６油脂含量的测定

采用离心法收集微藻细胞，培养液在１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ ｍｉｎ，弃上清，藻细胞沉淀用去离子水洗涤２次再离心，收集的藻细胞用冷冻干燥法进行干燥，干燥后的藻粉称重，保存待用。

用氯仿-甲醇法［５］提取油脂，测定干燥藻粉的油脂含量。

油脂含量＝（油脂质量／干燥藻粉质量）×１００％。

１．７数据处理

用统计软件ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５的单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）中的Ｄｕｎｎｅｔｔ＇ｓ多重比较进行数据差异显著性分析。

２结果与分析

２．１乙酸钠对三角褐指藻生长及油脂积累的影响

试验中发现该株三角褐指藻具有利用乙酸钠进行兼养生长的能力，不同浓度乙酸钠作为碳源对三角褐指藻比生长速率的影响如图１所示。由图１可知，添加不同浓度乙酸钠后三角褐指藻的比生长速率均显著高于对照（Ｐ＜０．０５），但添加不同浓度乙酸钠各组之间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。在乙酸钠浓度为１．０ ｇ／Ｌ时，三角褐指藻的比生长速率达到０．２２８ ｄ－１。

不同浓度乙酸钠对三角褐指藻生物量和油脂含量的影响如图２所示，当乙酸钠浓度在１．０～５．０ ｇ／Ｌ时三角褐指藻的生物量均显著高于对照（Ｐ＜０．０５）。当乙酸钠浓度为５．０ ｇ／Ｌ时，采收到１．２８ ｇ／Ｌ的最大生物量，是对照（０．７６ ｇ／Ｌ）的１．７倍。添加不同浓度乙酸钠后三角褐指藻油脂含量均显著高于对照（Ｐ＜０．０５），当乙酸钠浓度为０．５ ｇ／Ｌ时，三角褐指藻油脂含量达到最大（２８．９０％），是对照（１５．２２％）的１．９倍。

２．２尿素对三角褐指藻生长及油脂积累的影响

不同浓度尿素对三角褐指藻比生长速率的影响如图３所示。由图３可知，当尿素浓度在６０．１～２３４．２ ｍｇ／Ｌ时，三角褐指藻的比生长速率均显著高于对照（Ｐ＜０．０５），但是添加不同浓度尿素各组之间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。当尿素浓度为４８０．５ ｍｇ／Ｌ时，显著地抑制了三角褐指藻细胞的生长（Ｐ＜０．０５）。

不同浓度尿素对三角褐指藻生物量和油脂含量的影响如图４所示。由图４可知，虽然添加尿素的情况下三角褐指藻的生物量均高于对照，但是差异不显著（Ｐ＞０．０５）。在不添加尿素条件下，三角褐指藻油脂含量可达２５．６５％，当尿素浓度在６０．１～４８０．５ ｍｇ／Ｌ时，其油脂含量随着尿素浓度的增加而增加，但与对照相比，差异不显著。

２．３Ｆｅ３＋对三角褐指藻生长及油脂积累的影响

不同浓度Ｆｅ３＋对三角褐指藻比生长速率的影响如图５所示。由图５可知，添加Ｆｅ３＋对三角褐指藻的生长没有显著促进作用（Ｐ＞０．０５）。当Ｆｅ３＋浓度为３４．７ ｍｇ／Ｌ时，反而对三角褐指藻细胞的生长有显著抑制作用（Ｐ＜０．０５），说明Ｆｅ３＋浓度过高会抑制三角褐指藻的生长。

不同浓度Ｆｅ３＋对培养基中三角褐指藻生物量和油脂含量的影响如图６所示。由图６可知，在培养基中添加不同浓度的Ｆｅ３＋后，三角褐指藻的生物量与对照相比无显著变化（Ｐ＞０．０５）。添加Ｆｅ３＋对三角褐指藻油脂含量的影响不显著（Ｐ＞０．０５）。

３讨论

本研究利用乙酸钠作为碳源得到的三角褐指藻最大生物量是对照的１．７倍，刘晓娟等［６］在三角瓶中利用乙酸钠静置培养的三角褐指藻最大生物量是对照的１．２８倍，说明在培养基中适当添加碳源能够明显促进三角褐指藻细胞的生长和生物量的增加，兼养培养时微藻细胞同时吸收ＣＯ２和有机碳源，在光能和有机碳的协同作用下进行生长，光合作用和有机碳的氧化磷酸化是独立进行的。Ｌｉｕ等［７］的研究表明添加有机碳源对呼吸作用的影响远远超过对光合作用的影响，表现为三角褐指藻的呼吸速率明显增加，从而促进了碳代谢，有利于生物量的增加。试验中发现添加不同浓度的乙酸钠后三角褐指藻油脂含量均显著高于对照（Ｐ＜０．０５），在乙酸钠浓度为０．５ ｇ／Ｌ时获得的最大油脂含量为２８．９０％，是对照的１．９倍。王海英等［８］的研究表明，同为添加碳源的兼养培养条件下的小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）在较低的光照下可以有效提高其油脂含量，达到对照组的１．５８倍，说明有机碳源的添加可以有效提高微藻细胞油脂的积累。

不同藻种对氮源的种类和浓度需求不同，本试验在培养基中添加适当浓度的尿素显著提高了三角褐指藻的比生长速率，但对生物量的提高差异不显著（Ｐ＞０．０５），该培养基中尿素的添加与否对三角褐指藻油脂积累的影响较小（Ｐ＞０．０５）。本试验在培养基中添加Ｆｅ３＋对三角褐指藻的生物量和油脂积累的影响差异不显著，但夏金兰等［４］发现三角褐指藻ＨＱＷ０２株系在含一定浓度的Ｆｅ３＋培养基中培养时呈最大生长速率，脂质含量是无Ｆｅ３＋培养时的２．８倍，这可能是藻种的差异造成的。

本试验中采用的基础培养基与培养硅藻常用的ｆ／２培养基相比，成分简单、易于配制、成本较低。从本试验的结果来看，培养基中不需要添加尿素与铁盐，添加合适浓度的乙酸钠就可以有效增加三角褐指藻的生物量和油脂含量。该方法以简单、快速、廉价的方式有效地提高了三角褐指藻的生物量和油脂积累。

参考文献：

［１］ ＣＨＩＳＴＩ Ｙ． Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，２００７，２５（３）：２９４－３０６．

［２］ 蒋汉明，高坤山． 氮源及其浓度对三角褐指藻生长和脂肪酸组成的影响［Ｊ］． 水生生物学报，２００４，２８（５）：５４５－５５１．

［３］ 王付冬，桑敏，李爱芬，等． 光照对眼点拟微绿球藻和三角褐指藻生长及总脂的影响［Ｊ］． 中国油脂，２０１０，３５（６）：７１－７５．

［４］ 夏金兰，李丽，万民熙，等． 两株微藻的分离鉴定及Ｆｅ３＋对其生长和脂质积累的影响［Ｊ］．武汉大学学报（理学版），２０１０，５６（３）：３２５－３３０．

［５］ ＢＬＩＧＨ Ｅ Ｇ，ＤＹＥＲ Ｗ Ｊ． Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９５９，３７（８）：９１１－９１７．

［６］ 刘晓娟，段舜山，李爱芬． 有机碳源对三角褐指藻生长、胞内物质和脂肪酸组分的影响［Ｊ］． 生物工程学报，２００８，２４（１）：１４７－１５２．

［７］ ＬＩＵ Ｘ Ｊ，ＤＵＡＮ Ｓ Ｓ，ＬＩ Ａ Ｆ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ， ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００９，２１（２）：２３９－２４６．

［８］ 王海英，郭祀远，郑必胜，等． Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ Ｖｕｌｇａｒｉｓ ｕｎｄｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ， ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｎｄ ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．华南理工大学学报， ２００４， ３２（５）：４７－５８．

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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