人工种子在盾叶薯蓣快速繁殖技术中的初步应用
[摘要] 目的：提高盾叶薯蓣试管苗的移栽成活率。方法：在组织培养的基础上，对盾叶薯蓣人工种子中人工种皮、人工胚乳制作、人工种子一次性成苗及移栽成活率等问题进行了初步研究。结果：人工种子快速繁殖的最适条件为：从盾叶薯蓣愈伤组织表面切取2～3 mm小块茎，包埋在2.5%海藻酸钠中，滴入2% CaCl2中反应8～10 min，人工胚乳MS/2+IAA 0.4 mg/L直接播种在MS/2培养基上，一次性成苗率可达100%左右，移栽成活率高达85%。结论：以组织培养为基础的盾叶薯蓣人工种子快速繁殖技术具有一定的优越性。
[关键词] 盾叶薯蓣；人工种子；快速繁殖技术
[中图分类号] Q94[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）05（a）-030-04
The elementary application of artificial seeds in the technique of rapid multiplication of D.zingibiernsis
XIE Caixia1, CUI Yongxia1, BAI Yan1, BAI Yu2, HU Ya"nan1
(1.Henan College of TCM, Zhengzhou 450008, China; 2.Research Institution of Tianjin Tasly Group, Tianjin 300410, China)
[Abstract] Objective: To improve the survival rate of the plantlets of D.zingiberensis. Methods: On the basis of tissue culture, the technique of artificial endosperm, artificial seeds of D.zingiberensis, the germination ratio of artificial seeds and the survival rate were investigated. Results: The condition of rapid multiplication of artificial seeds should be as following: cutting about 2-3 mm size embryo coming from callus, cultured embryo was encapsulated with 2.5% solidumalginate in IAA 0.4 mg/L solution and then dropped in 2% CaCl2 solution for 8-10 min, artificial seeds were germinated on the MS/2 medium. According to the above procedure, the germination ratio of artificial seeds could reach 100% or so and the survival rate could reach 85%. Conclusion: The technique of rapid multiplication of artificial seeds on the basis of tissue culture of D.zingiberensis has definite superiority.
[Key words] D.zingiberensis; Artificial seeds; Technique of rapid multiplication
自1978年Murashige[1]首次报道人工种子的概念以来，由于其在良种快繁、固定杂种优势、简化育种程序以及与基因工程、脱病毒等技术相结合等方面有着广阔的发展前景[2]而成为当前体细胞胚胎学及遗传学中的一个重要课题。目前，已从200多种植物中诱导出体细胞胚，但进行过人工种子实验的不超过40种[3-4]，这是由于作为人工种子包埋体的植物必须具备高频率、同步化的高质量胚状体发生系统。而1985年Kamada提出的以非体细胞胚为包埋材料的广义人工种子的研究大大扩展了人工种子的应用范围，开辟了人工种子技术的新天地。我国也于1987年列入国家高技术研究与发展计划（“863计划”）；周丽艳等[5]以腋芽为培养物进行甘薯人工种子的研究，薛建平等[6]对半夏的人工种子进行了研究；秦自清等[7]对霍山人工种子包埋繁殖体和萌发进行了研究。可见，人工种子的研究范围从过去的模式植物转向石斛、半夏等具有重要经济价值的粮食作物、观赏植物和药用植物，大大增加了它的应用价值与商业价值。组织培养是目前应用最为广泛的快速繁殖技术，盾叶薯蓣作为薯蓣皂苷元重要的提取原料，其组织培养技术已相对成熟，但由于盾叶薯蓣试管苗田间移栽成活率较低，限制了其快速繁殖技术的广泛应用。基于此，本文在组织培养的基础上，对盾叶薯蓣人工种子中人工种皮、人工胚乳制作，人工种子一次性成苗及移栽成活率等问题进行了初步研究，以期建立更好的快速繁殖方法。
1 仪器与试药
1.1 实验材料
盾叶薯蓣采自江苏省植物所，栽培于中国药科大学实验苗圃，原植物经江苏省植物所丁志遵、秦慧贞老师鉴定为盾叶薯蓣。选取幼嫩的盾叶薯蓣叶片和茎段，肥皂水清洗15 min，用流水冲洗1 h左右，在超净工作台上，先在75%酒精中浸泡30 s，再放入0.1%升汞溶液中（加3～5滴Tween-20）消毒15 min，无菌水冲洗5次。根据实验在不同培养基上诱导愈伤组织和丛生芽作为实验材料。
1.2 仪器
超净工作台，冰箱，培养箱，灭菌器。
1.3 试剂
海藻酸钠，CaCl2，琼脂粉，BA，IAA，蔗糖。
2 实验方法与结果
2.1 包埋剂浓度对盾叶薯蓣包埋丸形成质量及时间的影响
取幼嫩茎或叶片在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织，从愈伤组织表面剥取直径2～3 mm的小块茎，用蒸馏水配制浓度为2.0%～3.5%的海藻酸钠溶液和2% CaCl2溶液，湿热灭菌后，采用滴注法，将包有小块茎的半凝胶状态海藻酸钠滴到CaCl2溶液中，浸泡一定时间后捞出，无菌水中浸洗，观察人工种子质量。整个过程如图1所示，结果见表1。
由表1可知，不同浓度的海藻酸钠对人工种子形成的时间和质量有很大的影响：浓度过低，形成时间长，形状不规则，颗粒不均；浓度过高，虽然形成时间大大缩短，但人工种子的硬度太大，浑浊，不透明；只有浓度适中时，才能在适宜的时间形成颗粒均匀、透明、硬度适合的合格人工种子。因此，2.5%海藻酸钠在2% CaCl2溶液中反应8～10 min是盾叶薯蓣人工种子的最佳制作条件。
2.2 不同人工胚乳对盾叶薯蓣人工种子发芽的影响
取盾叶薯蓣在MS+BA 0.2 mg/L培养基上诱导的愈伤组织和愈伤组织在MS+BA 0.05 mg/L培养基上诱导的丛生芽，按照图1所示流程，添加不同的人工胚乳成分制作人工种子。制作好的种子播种在含有MS/2培养基的三角瓶中。培养温度（25+1）℃，光照强度1 500 lx，每天16 h。观察人工种子的发芽情况及芽长势，分别计算10、20、30 d的发芽率。测定结果见表2。
表2结果显示，以芽作为包埋材料时，不同的营养元素和激素对盾叶薯蓣人工种子萌发有明显的影响。6-BA抑制种子萌发，IAA和蔗糖则促进萌发；种皮内添加MS、MS/2或MS/4基本培养液与用蒸馏水的效果基本相同，说明在保证营养元素充足的情况下，影响人工种子发芽的主要是激素的种类和浓度。用愈伤组织作包埋材料时，6-BA的抑制作用更加明显，这可能与愈伤组织残留了部分的6-BA有关。芽长势方面，单纯加蔗糖，由于营养元素缺乏，芽较矮，甚至生根，加入一定量的营养元素可以使芽正常生长；另外加入适量BA，芽数增加，芽长势较好；加入IAA后，叶梗发紫，而且大多生根。
2.3 盾叶薯蓣人工种子一次性成苗实验
取盾叶薯蓣在MS+BA 0.2 mg/L培养基上诱导的愈伤组织及愈伤组织MS+BA 0.05 mg/L培养基上诱导的丛生芽，按图1所示流程，添加不同人工胚乳成分制作人工种子。制作好的种子播种在含有不同激素种类和浓度的MS/2生根培养基中。培养温度（25+1）℃，光照强度1 500 Lx，每天16 h。同时，取盾叶薯蓣在MS+BA 0.05 mg/L培养基上诱导的丛生芽，放在生根培养基中，30 d后，观察各处理芽的生根情况。结果见表3、4及图2。
结果显示，人工种子一次性成苗率整体上高于丛生芽一次性成苗率，而且不同人工胚乳人工种子一次性成苗率相差很大，BA抑制生根，IAA生根效果优于NAA。另外，包埋材料不同，一次性成苗率也相差很大，如果用芽作为包埋材料，一次性成苗率最高仅为74.1%，最低为42.8%；但以愈伤组织作为包埋材料时，几种人工胚乳的成苗率最低仅为86%，最高达100%。
图2由人工种子形成的植株
2.4 盾叶薯蓣人工种子移栽成活率实验
分别将由盾叶薯蓣丛生芽在MS/2+IAA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上诱导的试管苗和用MS/2+BA 0.1 mg/L诱导的愈伤组织作为包埋材料，取出人工胚乳为MS/2+IAA 0.1 mg/L的人工种子在MS/2培养基上诱导的试管苗，小心洗去苗上的培养基。傍晚栽入以蛭石和复合肥为基质的苗床中，每天中午喷雾2 h保湿，使其在自然条件下生长。30 d后统计成活率，结果见表5。
表5 不同材料诱导的盾叶薯蓣试管苗移栽成活率
由表5可知，不同材料诱导的盾叶薯蓣试管苗于春季不同时间移栽到苗床中，1个月后成活率有较大差异。用人工种子诱导的试管苗均比用芽诱导的试管苗移栽成活率高。用人工种子诱导的试管苗移栽成活率最高为86%，最低为67%；而用芽诱导的试管苗移栽成活率最高仅为53%。
3 讨论
由实验可知,在组织培养基础上，盾叶薯蓣人工种子一次性成苗的条件为：取盾叶薯蓣幼嫩茎或叶片，在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织，从愈伤组织表面剥取直径2～3 mm的小块茎，加入2.5%海藻酸钠，滴注法滴入2% CaCl2溶液中反应8～10 min，人工胚乳MS/2+IAA 0.4 mg/L，直接播种在MS/2+IAA 0.4 mg/L的培养基上，一次性成苗率达100%，田间移栽成活率最高可达85%。
常规组织培养获得的试管苗根系不发达，有时会出现畸形，这种情况可能会导致田间成活率低。由本研究结果知，芽诱导试管苗和人工种子一次性成苗技术都可以作为盾叶薯蓣试管苗的快速繁殖手段，与芽诱导试管苗相比，人工种子诱导的试管苗生根率高，根系发达，移栽成活率高。两种快速繁殖手段的结合，可有效地解决盾叶薯蓣繁殖周期长、种苗短缺的问题。同时可以在实验室条件下，利用这种技术进行株系的诱导与良种选育，与常规育种方法相比，具有很大的优越性。
目前人工种子的研究仍处于探索阶段，许多问题亟待解决，如人工种皮、防腐、贮藏、运输、在体外条件及类似土壤的底物中转化率较低、制作成本高、主要靠手工操作等一系列的难题。这些难题的解决涉及细胞工程学、植物胚胎学、植物生理学、生物化学和高分子化学、机械加工等技术领域，所要求的技术水平较高。但应该相信，随着经验的积累和研究的深入，限制其在商业应用中的问题将逐步得到解决，实现其诱人的应用前景。
[参考文献]
[1]Murashige T. The impact of plant tissue culture on agriculture[M]//Thorpe T. Frontiers of plant tissue culture. Canada: Assn for Tissue Cult Vnit Univ of Calgary,1978:15-26.
[2]陈正华,Kieth Redenbaugh.人工种子[M].北京:高等教育出版社,1990:1-13.
[3]Redenbaugh K, Viss P, Slade D, et al. Scale-up: artificial seeds.//Green CE. Plant tissue and cell culture [M]. New York:Liss,1987:473-493.
[4]林正斌,叶茂生.人工种子的制作及应用[J].科学农业(台湾),1993,41(1):36-41．
[5]周丽艳,高书国,毕艳婧,等.甘薯腋芽人工种子的研究[J].种子,2003,6(3):51-52.
[6]薛建平,张爱民,葛红林,等.半夏的人工种子技术[J].中国中药杂志,2004,24(5):402-405.
[7]秦自清,赵婷,邱婧,等.霍山石斛人工种子包埋繁殖体和萌发[J].生物工程学报,2008,24(5):803-809.
（收稿日期：2008-12-26）