两种牛结核病检测方法的比较探索

摘 要 目的：比较两种牛结核病的检测方法。方法：选择某奶牛场16头奶牛，分别利用变态反应试验与y-干扰素平行对比试验进行科学检测，比较两种方法的检测结果。结果：两种检测方法的相符率高达93.75%，有且只有一头牛出现两种检测方法不一致的情况。结论：变态反应试验适合在基层疫控机构推广，y-干扰素平行对比试验基于目前我国没有引进且成本高，推广起来有很大的难度。

关键词 牛结核病；检测方法；比较探索

本次研究的主要目的是对两种方法检测牛结核病的结果进行科学比较，从某奶牛场中挑选16头奶牛为分析对象，同时给予不同的方法进行检测，具体情况分析如下：

1 材料与方法

1.1 一般资料

试剂：从哈药集团生物疫苗有效公司选购牛结核菌素 ，批号为201001；进口分装y-干扰素检测试剂由我国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室所提供。

试验动物：选择某奶牛場的存栏奶牛为研究对象，该牛场大约有70头寸栏奶牛，产奶量普遍较低，奶牛的消瘦呈现出非常明显的渐进性，在2016年9月秋季检测出牛结核病阳性牛，现从中选出严重消瘦的奶牛共16头，进行从1到16进行编号。

1.2 方法

1.2.1 牛分支杆菌结核菌素变态反应

严格根据《动物结核病诊断》中的规定进行操作，不管牛大小，统一在皮下注射牛型结核分支杆菌PPD0.1ml，在72小时之内对各种炎性反应进行仔细观察，如局部是否出现肿胀和热痛等，在此基础上利用卡尺对皮皱厚度进行仔细测量。若皮厚差在2毫米以下则为阴性牛，皮厚差超过4毫米则为阳性牛，皮厚差在2～4毫米之间则为疑似牛[1]。

1.2.2 y-干扰素平行对比试验

严格按照相关规程进行操作。第一，进行全血培养，利用肝素真空采血管将16头奶牛的血液采集起来，在25摄氏度下的条件下放置6小时，然后在24孔组织培养板中加入，将三管1.5ml分装抗凝血分别给每头牛，比高分别将PBS、禽PPD和牛PPD（刺激抗原）分别加入到三管中，在37摄氏度湿温培养箱中进行18小时的孵育，将上层血浆每孔400ul收集起来；第二，进行牛y-干扰素酶免疫试验[2]；第三，4个小时后在酶标仪上对OD450mm数值进行读取。

2 结果

2.1 变态反应

牛结核菌素在注射3天后，1头牛皮厚差为3.90毫米，与4.00毫米接近，所以被判定为疑似阳性；1头牛皮厚差在2.00毫米以下为阴性牛；剩余14头牛的注射部位出现明显的炎症，且皮厚差超过4毫米，经初步判定诊断为阳性牛。

结束变态反应试验的第2天，便可以进行牛结核分支杆菌y-干扰素检测。

2.2 牛结核分支杆菌y-干扰素检测

检测结果：阴性对照平均OD值为0.0556，阴性对照小于0.130；阳性平均0D值对照为2.119，阳性对照大于0.700；各阴性对照重复孔差值低于0.040，阳性OD值变化幅度低于平均值的30%，表示试验成立。

全部样本阴性抗原HE 、禽PPD抗原和牛PPD抗原OD值分别等于0.0696、0.189和1.02。

关于变态反应结果与牛y-干扰素检测结果相符的牛一共有15头，两组检测结果不一致的只有2号牛，其变态反应为弱阳性、牛y-干扰素为阴性。9号牛经两种方法检测均为弱阳性，被判定是疑似阳性。两个月后，经变态反应试验，72小时内2号牛的皮厚差在2.00毫米以下为阴性牛 ，9号皮厚差为3.85毫米并俩月后经变态反应试验 ，皮厚差为4.80毫米，为阳性牛。

3 结果分析与比较

3.1 根据上述检测结果发现，经y-干扰素检测进行平行对比试验，93.75%（15/16）与变态反应一致。

3.2 两种检测方法对2号牛检出不一致的结果，这与在对皮厚差进行测量时，牛的保定情况和人员主观性操作有很大的影响， 致使误差严重存在。

3.3 变态反应具有一系列优点，诸如低成本、简单操作和高检出率。然而，试验过程中往往需要耗费很长时间，在操作和解释上主观性比较强。Y-干扰素所具备的优点：高检出率、可以缩短耗时，可以用于测试牛群大量样品，且不存在抗原浸入的情况，然后成本一般比较高，试剂价格非常贵，当下我国并没有出售适量规格的试剂盒[3]；尤其应用地塞米松类药物必然会会对y-干扰素的检测产生较大的影响，检测必须在采血8小时后进行，且必须严格操作过程，对操作者提出了较高的要求。在上述因素的影响下，在检测牛结核病的过程中，y-干扰素还没有得到大力推广，推广过程中势必会面临很大的难度。特别是对于基层疫控机构而言 ，比较切实可行的是变态反应试验。

4 讨论

牛结核病是作为一种人畜共患的慢性传染病，主要是在牛与结核分支杆菌的共同作用下所造成的，在一定程度上已经对人们的生命健康与畜牧业的发展造成了严重威胁。现阶段，牛结核病已经被某些发达国家采取有效方法得以控制，但是对于第三世界的国家来说，该病仍然大面积的传播。检测后将阳性牛淘汰是净化牛结核病的一种重要方法。现阶段，结核菌素变态反应试验 是世界动物卫生组织所推荐使用的检测牛结核病的主要方法，另一种血清学诊断试验-IFN-y则是国际畜牧业发达国家刚刚兴起的[4]。

在本次研究中，变态试验反应和y-干扰素分别具备不同的优点与缺点，但是在基层疫苗机构中，由于经费不足、科学技术跟不上，致使不能充分的推广y-干扰素，而变态反应试验尽管需要耗费很长得时间，操作与解释均存在较大的主观性，但是成本低、操作简单和检出率高，因此可以在基层疫苗机构进行大力推广。

参考文献：

[1]吴亚文，王晓亮，张玉玲，王玉梅，李志红，张学军. γ-干扰素ELISA检测方法在牛结核病流行病学调查中的应用[J]. 中国动物检疫，2016，33（09）：78-80.

[2]于青海，李玉杰，孔祥华，姜秀云，陈静，马慧玲，蔺晓月，刘丽平，徐鸿，孙圣福，田夫林. 牛结核病PPD皮内变态反应和ELISA检测方法对比分析[J].中国畜禽种业，2015，11（09）：53-54.

[3]徐正中，单法，单锋丽，孟闯，解晓莉，刘佳莹，闵晶晶，陈祥，焦新安.牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立[J]. 生物工程学报，2015，31（02）：183-194.

[4]杨莉，刘付强，田孟林，吴位珩，杨茂生，宋大书. 两种奶牛结核病检测方法的比较试验[J]. 上海畜牧兽医通讯，2014，（05）：45-46.

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