利用青海大黄油菜与黑芥人工合成芥菜型油菜
摘要：以芸薹属植物青海大黄油菜（Brassica rape）和黑芥（Brassica nigra）为研究对象，对其常规杂交后，通过离体胚培养获得的杂种种子经MS培养基诱导培养成苗，获得了青海大黄油菜与黑芥的杂种F1代植株，形态上表现为中间类型。通过细胞学的方法，鉴定了杂种F1代植株的细胞染色体数为18条，为母本青海大黄油菜（2n=AA=20）和父本黑芥（2n=BB=16）的配子染色体数之和；SSR分子鉴定进一步表明，该杂种植株为真杂种。
关键词：青海大黄油菜（Brassica rape）；黑芥（Brassica nigra）；种间杂交；胚培养；芥菜型油菜
中图分类号：X565.4；S334.3文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1746-04
New Brassica juncea Sythesized from Interspecific Hybridization Between B. rapa（Qinghai dahuang） and B. nigra
ZHAO Zhi-Gang
（Academy of Agriculture and Forestry， Qinghai University/National Key Laboratory Breeding Base for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm/Key Laboratory of Spring Rape Genetic Improvemen of Qinghai Province， Xining 810016， China）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ａｎｄ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｎｅｗ Ｂｒａｓｓｉｃ ｊｕｎｃｅａ ｃａｎ ｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｒａｐａ ａｎｄ Ｂ． ｎｉｇｒａ ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂ． ｒａｐａ×Ｂ． ｎｉｇｒａ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｓｈｏｏｔ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｈａｄ ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ． Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｏｆ Ｆ１ ｐｌａｎｔｓ ｈａｄ １８ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｓｕｍ ｏｆ ｇａｍｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｂ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（２ｎ＝ＡＡ＝２０） ａｎｄ ｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｂ． ｎｉｇｒａ（２ｎ＝ＢＢ＝１６）． ＳＳＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒｕｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｒａｐａ（Ｑｉｎｇｈａｉ ｄａｈｕａｎｇ）ａｎｄ Ｂ． ｎｉｇｒａ． Ｔｈｅ rｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｎｇｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉａｃ ｊｕｎｃｅａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｑｉｎｇｈａｉ Ｄａｈｕａｎｇ ｒａｐｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐｅ）； Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ； ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄ； ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ
芸薹属植物由白菜（Brassica pekinensis， 2n=AA=20）、甘蓝（B. oleracea，2n=CC=18）、黑芥（B. nigra， 2n=BB=16）3个基本种和甘蓝型油菜（B. napus，2n=AACC=38）、埃塞俄比亚芥（B. carinata，2n=BBCC=34）、芥菜型油菜（B. juncea，2n=AABB=36）3个复合种组成，是一个遗传类型极其丰富、变异极其广泛的基因库，这为芸薹属植物的种间杂交或与近缘属的属间杂交以及培育或创造作物新品种、新类型提供了丰富的物质基础及遗传背景。近年来，人们对属内各个种进行了遗传、育种、栽培等方面的研究，为各个种的综合利用奠定了坚实的基础。同时，进行了大量的种间杂交、属间杂交，探讨了种属间关系，创造出大量的遗传育种新材料，推动了油菜遗传育种的研究。李再云等［1，2］、徐利远等［3］研究了甘蓝型油菜与诸葛菜、蓝花子间的远缘杂交，以及诸葛菜、蓝花子与芸薹属的亲缘关系和杂种后代的细胞学行为。文雁成等［4］、张国庆等［5］利用甘蓝与白菜杂交，进行了人工合成甘蓝型油菜的研究，拓宽了甘蓝型油菜的遗传基础。Chen等［6］利用甘蓝型油菜和白菜型油菜品种，Poulsen等［7］利用埃塞俄比亚芥和甘蓝型油菜品种，Meng等［8］利用白菜和埃塞俄比亚芥与甘蓝型油菜品种进行种间远缘杂交，将不同优良性状导入到甘蓝型油菜中，创造了大量遗传育种的中间材料。
青海大黄油菜是青海农家白菜型油菜品种，近年来育种工作者在育种实践中发现大黄油菜粒大、种皮鲜黄、能自交结实，表现出一系列的优良性状，但国内外目前还未对该品种资源的优良特性进行较系统的研究，也鲜见将该资源应用于油菜育种中。因此，利用青海大黄油菜与黑芥种间有性杂交，将青海大黄油菜的优良性状转入到芥菜型油菜中，再以新型的芥菜型油菜去转育现有的芥菜型油菜品系，可以获得自然界没有的芥菜型油菜新资源。然而，不同种、属或亲缘关系更远的个体间的远缘杂交存在杂交不亲和性和杂种后代生活力弱等缺点。在十字花科植物中， 青海大黄油菜和黑芥属于不同种的植物， 二者存在严重的杂交不亲和性，胚挽救和子房培养等技术能够用来克服杂交不亲和性， 提高杂交效率。因此，本试验通过青海大黄油菜与黑芥的杂交，适时摘取正在发育的胚进行离体培养，获得了青海大黄油菜与黑芥的杂交F1代幼苗，并对幼苗进行了形态学、细胞学和分子标记的鉴定。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料为青海大黄油菜和黑芥。上述材料均由青海省农林科学院春油菜研究所提供，并于2012年4月种植于青海大学农林科学院四号试验基地。
1.2方法
1.2.1种间有性杂交2012年6月，选取生长健壮的青海大黄油菜为母本，摘除已开花的花蕾和过小的花蕾，对尚需2~3 d后才能开花的花蕾进行剥蕾去雄，授以黑芥的新鲜花粉，每次授粉完成后立即套袋。
1.2.2胚抢救、快繁及染色体加倍试验以青海大黄油菜×黑芥组合为研究对象，从杂交后10 d开始解剖、观察胚的发育情况以确定最适培养时间。杂交后18~22 d，将取回的子房先用70%的乙醇处理2 min，再用0.1%的氯化汞消毒处理15 min后，用无菌水洗3次，每次5 min，在超净工作台上，用消毒的镊子在无菌滤纸上小心将幼胚剥出，放在含有3%蔗糖的MS固体培养基上培养，在25 ℃的光照培养室培养直到分化成苗，成苗后将无菌苗转到含有0.25 mg/L NAA（a-萘乙酸）、1.5 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤）的MS固体培养基上进行快速繁殖。15~20 d后，幼苗转入含0.1 mg/L NAA的MS生根培养基进行生根培养。将幼苗移栽温室30 d后，再将部分苗子挖出，用100 mg/L的秋水仙素溶液浸泡幼苗的根部3~4 h，后用清水连续冲洗5~6次，再次栽于温室中。试验中所用各培养基成分具体见表1。
1.2.3真假杂种鉴定试验
1）F1代植株形态学观察。2013年3~5月，观察、记载F1代杂种植株生长发育不同阶段的形态变化，并照相。
2）普通细胞学鉴定。用0.002 mol/L的8-羟基喹啉处理F1植株幼小花蕾中的子房，3 h后用卡诺固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定24 h后，室温保存。取固定好的子房用1 mol/L的HCI在60 ℃恒温水浴锅中水解5~8 min，用10%改良卡宝品红染色并压片，在显微镜下观察并记录染色体数目。
3）杂种后代的分子鉴定。采用CTAB小样法提取油菜基因组DNA，利用SSR标记进行真假杂种鉴定，其PCR反应体系为：10×buffer（含Mg2+）1.00 μL，10 mmol/L dNTPs 0.80 μL，5U Taq酶0.15 μL，50 ng/μL引物各0.25 μL，50 ng/μL DNA 1.00 μL，ddH2O 6.55 μL。其中Taq酶和dNTPs均购自大连宝生物有限公司， SSR引物由上海生工合成，本研究所用引物名称及序列见表2。
2结果与分析
2.1远缘杂种的获得
2011年以青海大黄油菜为母本、黑芥为父本进行杂交授粉，授粉后30 d左右取回荚果，剥离胚珠，发现大多数胚在发育过程中夭亡，荚果内只剩下种皮，没有获得远缘杂交的种子。2012年从授粉后10 d开始解剖观察胚的发育情况，以此确定最适胚抢救时间。结果表明，授粉26 d后部分胚珠珠被开始皱缩变白，在以后的几天里胚珠逐渐变褐发黑，胚乳已经败育，胚珠逐渐死亡，统计结果见表3。综合以上调查结果，对所有杂交组合在杂交授粉后22 d取材进行胚培养是最适培养时间。
2.2杂种形态学观察与性状分析
杂种苗分为2批种植于温室，其中一批经过秋水仙素进行染色体加倍，一批未加倍。未经过加倍的杂种苗生长旺盛，叶子的颜色和形状介于青海大黄油菜与黑芥之间，叶面上生有小刺毛，特别是叶子边缘上的刚毛比较明显，这一点与父本黑芥相同，叶边缘锯齿状较浅，介于父本和母本之间（图1）。从成熟植株的形态看， 杂种植株分枝较多， 分枝部位较低。在现蕾期和开花期，杂种植株的花药全部退化。
2.3染色体加倍效果
用秋水仙素处理20株杂种幼苗根部以进行染色体加倍，结果显示秋水仙素对其有明显的毒害作用，部分植株茎尖缩短，部分植株基部溃烂、死亡，只有9株能正常生长，开始长势良好，但1个月后，9株正常生长的幼苗依次从基部的叶片开始变黄，直至全部死亡。本研究没有获得染色体加倍成功的人工芥菜型油菜，在没有进行加倍处理的植株中也未发现自然加倍植株。
2.4杂种后代的细胞学鉴定结果
青海大黄油菜的体细胞染色体数为20条，父本黑芥的体细胞染色体数为16条。对杂交后胚培养获得的F1代幼小子房进行了体细胞观察，发现杂种体细胞具有18条染色体（图2），为青海大黄油菜（n=10）和黑芥（n=8）配子染色体数目之和， 在细胞学水平上进一步说明了F1代植株是真杂种。
2.5杂种后代的SSR分子标记鉴定结果
取亲本和F1植株的幼嫩叶片提取DNA，进行SSR分子标记鉴定，10对引物中引物SSR549和SSR646在亲本青海大黄油菜和黑芥中分别检测到特异性条带，因此这两对引物可用于种间杂种F1植株的鉴定。对所获得的7株F1杂种植株SSR分子标记鉴定结果表明，由青海大黄油菜与黑芥杂交得到的F1杂种植株同时具有父、母本的特征带（图3），为真杂种。
3讨论
3.1子房培养与胚培养的有效性
由于青海大黄油菜和黑芥的种间杂交不亲和性，大田条件下很难收获到它们的种间杂种。在本次试验中，所有的正交组合（青海大黄油菜×黑芥）和反交组合中（黑芥×青海大黄油菜）都通过胚抢救来获得杂种，但是，仅在正交组合中获得了杂种，反交组合均未成功获得杂种。Watkins［9］认为不同染色体数目的种间杂交时采用染色体数目高的作母本较易成功。Müntzing［10］也曾提出一个假说， 种子各部分的染色体数必须是母本组织∶胚乳∶胚=2∶3∶2，如果这一比例因倍数不同的种间杂交而扰乱就会发生败育情形，本研究的结果与这些假设基本一致。同时，Inomata［11］的研究表明，子房培养能大大提高白菜×甘蓝组合的杂种获得率，而对于反交组合甘蓝×白菜却没有效果，而Takeshita等［12］在甘蓝和白菜杂交组合中的研究表明，胚抢救技术更适用于以甘蓝为母本的杂交组合，考虑到以上情况，作者认为在反交组合中应该先利用子房培养，再进行胚培养，能否获得反交的杂种幼苗有待进一步研究。
3.2胚培养的最适时间
本研究结果表明，在以青海大黄油菜为母本的组合中，杂交授粉后22 d取材进行胚培养最易成功。由于各个组合胚胎败育发生的时间不同，最适取材时间也就不同，因此胚抢救的最佳取材时期也许会因杂交组合的不同而不同，授粉后，过早或过迟取胚离体培养都不利于获得杂种苗。这可能是因为胚在早期发育比较小，不易从种子中分离以及胚的早期发育对营养条件要求很严格，简单的培养基无法满足其要求，因而离体培养难以成功；而授粉后时间过于延长，杂种核与细胞质的代谢或杂种胚胎与胚乳的发育不协调性增强，导致杂种胚凋亡，无法挽救，因此，适时将杂种胚进行离体培养，提供适宜的营养环境及发育的外界环境，可能有利于降低代谢的不协调性，提高胚培养成功率［13］。
3.3染色体加倍效果
染色体加倍对远缘杂种的保存和利用具有较重要的意义。在本试验中通过秋水仙素处理并未获得染色体加倍的植株。在前人人工合成甘蓝型油菜的研究中，也发现个别组合杂种难以加倍，比如DB（白菜型油菜）×T4（羽衣甘蓝）的杂种，即使后来在现蕾期用0.5%的秋水仙素溶液浸根4 h也没有加倍成功［14］。本次试验中加倍处理时间不足，加之秋水仙素有一定的毒害作用，导致幼苗没有加倍或加倍后被毒害死亡，原因和加倍方法的改进有待进一步研究。在没有进行加倍处理的植株中也未发现自然加倍植株，说明人工芥菜型油菜的加倍效率较低。
3.4芥菜型油菜人工合成种应用前景
青海大黄油菜属白菜型油菜地方品种，子粒鲜黄、千粒重高（6.6 g）、含油量高（41.09%）、自交亲和性强（亲和指数为11.85）、皮壳率低（12.8%）、粒色性状遗传稳定，是一个优良的黄子种质资源［15］。本试验从形态学和细胞学对杂种进行了真假杂种鉴定，同时采用了SSR分子标记法进一步证明了该杂种是真杂种，为进一步将青海大黄油菜的优良性状转入芥菜型油菜中奠定了基础，达到拓宽芥菜型油菜种质资源的目的。
参考文献：
［1］ 李再云，刘后利.甘蓝型油菜与诸葛菜的属间新杂种［J］. 华中农业大学学报，1995，14（1）:33-37.
［2］ 李再云，吴建国，石淑稳，等.甘蓝型油菜与诸葛菜属间杂种的减数分裂观察［J］.遗传学报，1997，24（4）:373-379.
［3］ 徐利远，杨吉秀，宣朴，等.油菜与蓝花子远缘杂交的研究［J］. 西南农业大学学报，1995，17（2）:102-106.
［4］ 文雁成，张书芬，王建平，等.对甘蓝与大白菜种间杂交合成的甘蓝型油菜的研究［J］.中国油料作物学报，1999，21（4）:8-11.
［5］ 张国庆，唐桂香，周伟军.白菜型油菜和甘蓝杂交子房培养初步研究［J］.中国农业科学，2003，36（11）:1409-1413.
［6］ CHEN B Y， HENEEN W K， JOSSON R. Resynthesis of Brassica napus L. through interspecific hybridization between B. alboglabra bailey and B. campestris L. with special emphasis on seed color［J］. Plant Breeding，1988，101（1）:52-59.
［7］ POULSEN M H， RAHMAN M H， Sorensen H. Interspecific crossing of Brassica carinata and B. oleracea for breeding yellow-seeded B. oleracea/B. napus［A］. GCIRC.Proceedings of 8th International Rapeseed Congress［C］. Saskatoon，Canada: GCIRC，1991.197-202.
［8］ MENG J L， SHI S W， GAN L， et al. The production of yellow-seeded Brassica napus （AACC） through crossing interspecific hybrids of B. campestris （AA） and B. carinata （BBCC） with B. napus［J］. Euphytica，1998，103（3）:329-333.
［9］ WATKINS A E. Studies on meiosis in diploid and incompatibility［J］. J Genet，1932，25：125-162.
［10］ M?譈NTZING A. Studies on meiosis in diploid and triploid solanum tuberosum［J］. Hereditas，1933，17（2）:223-245.
［11］ INOMATA N．Production of interspecific hybrids between Brassica campestris and Brassica oleracea by culture in vitro of excised ovaries II. Effect of coconut milk and casein hydrolysate on the development of excised ovaries［J］. Japan J Genet， 1978，53（1）:1-11.
［12］ TAKESHITA M， KATO M， TOKUMASU S. Application of ovule culture to the production of intergeneric and interspecific hybrids in Brassica and Raphanus［J］. Japan J Genet， 1980，55:373-387.
［13］ 王爱云.白菜型油菜和诸葛菜远缘杂交的子房培养及杂种鉴定［J］.中国油料作物学报，2009，31（2）:143-148.
［14］ 文静.芸薹属种间杂交合成甘蓝型黄籽油菜及杂交后代的研究［D］.武汉：华中农业大学，2008.
［15］ 罗玉秀，杜德志.青海大黄油菜主要农艺性状研究［J］.西北农业学报，2007，16（1）:136-139.