肠道寄生虫粪便的病原学检查方法
[摘要] 在实验动物病原检测中，寄生虫检测是其中重要的分支，也是体现实验动物质量不可或缺的一个方面。寄生虫侵入宿主可在宿主体内产生多种有害作用包括夺取营养，机械性损伤，继发感染，毒性作用等，严重影响实验动物健康并降低实验动物的质量。许多寄生虫生活史中虫卵、卵囊、或幼虫随宿主的粪便排出体外，这些都可以通过粪便寄生虫检查，确定是否感染寄生虫以及感染的种类和程度。病原学检查是诊断寄生虫成虫及虫卵的重要的实验技术，采集粪便做粪便检查又是诊断实验动物消化道有无寄生虫感染比较常用的手段。实验动物粪检的病原学方法有多种。本文列举并介绍了一些目前比较常用的粪便寄生虫定性和定量的检查方法，旨在提高粪便寄生虫病原学检查的技术水平。
[关键词] 肠道寄生虫；粪便；病原学检查方法；实验动物质量
[中图分类号] R446 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2016）20-213-05
Pathogenic examination methods of Intestinal parasite stool
PAN Yan JIANG Zirui ZHOU Chao LI Caiyun
Shanghai Yinuosi Biological Technology Co.Ltd.，National Shanghai New Drug Safety Evaluation Research Center，Shanghai 201203，China
[Abstract] In the experimental animal pathogen detection，the parasite detection is one of the important branches，and it is also an indispensable aspect of the quality of experimental animals.Parasitic invasion of the host can produce a variety of harmful effects in the host body including the seizure of nutrients，mechanical damage，secondary infection，toxic effects，seriously affect the experimental animal health and reduce the quality of experimental animals.Many parasites in eggs and oocysts，or host larvae with the faeces excreted through feces，which can determine whether the parasite examination，parasite infection and infection type and degree.Etiological examination is an important diagnostic technique of parasite egg and adult feces collection，do stool examination is the diagnosis of digestive tract have no experimental animal parasitic infections more commonly used methods.There are many kinds of pathogenic methods in laboratory animal feces examination.This article lists and describes some of the more commonly used methods of qualitative and quantitative examination of fecal parasites，aimed at improving the technical level of fecal parasite pathogens.
[Key words] Intestinal parasites；Stools；Pathogenic examination method；Laboratory animal quality
根據现行的2001版中国国家标准实验动物寄生虫学检测方法，不同种属动物体内体外寄生虫有其适用的检测方法，这些方法是经过很多检测人员反复实践得出的结论。比如大，小动物蠕虫的检测方法国标上写的有饱和盐水漂浮法，沉淀集卵法，透明胶纸法等[1]。必须指出的是粪便排泄物检查，跟以下6点密切相关：粪便的稠度、粪便的颜色、粪隐血指标、粘液、排泄物的有效期及显而易见的寄生虫[2]，这6点会直接影响到检测结果。本文对当下诸多检测方法的检测步骤及其影响因素进行了详尽的阐述。
1 粪便样品的收集和保存
寄生虫检查的粪便样品应该从动物的直肠收集，如果直肠不能获得新鲜的粪便样品，可从牧场收集[3]。样品应尽快地收集到合适的容器中，如带盖的塑料容器、螺旋盖瓶、塑料杯、塑料袋和玻璃瓶等。收集时应清楚地标识日期、时间地点和数据，动物的种类、动物的名称和其他一些相关信息。粪样尽量保存在冰箱里以避免卵的孵化。如果运输到实验室的时间较长，需添加少于5%的氯仿或者加入10%的福尔马林防腐（但不能用于粪便培养物）。样品应立即储存在4℃，直到实验室接收。样品可以保持在冰箱中长达3周而虫卵的数量和形态不发生改变。如果检查的目的是查找原虫滋养体，那必须立即检查样品；其他寄生虫检查也须在24h内完成。但凡遇到粪便不能立即检查，可在收集的粪样中加入已加热至50～60℃的5%～10%的福尔马林，既可防止微生物繁殖，又能使虫卵保持固有的形态不变[4]。
2 粪便寄生虫定性的病原学检查方法
2.1 粪便中虫体检查（fecal parasite examination）
从粪便中淘取蠕虫虫体进行虫体鉴定和技术，用来鉴别诊断或观察驱虫疗效。取服药后1～3d的粪样，加入蒸馏水搅拌混匀，用纱布或40目的筛网过滤粪样，过滤后的粪渣用蒸馏水反复冲洗，然后倒入装有蒸馏水的大的玻皿内检查。若粪渣当中混有虫卵，可以在玻皿的下方衬一张黑纸进行辨别。
2.2 直接涂片检查法（direct smear method）
2.2.1 生理盐水直接涂片法 滴加一滴生理盐水在载玻片的中间部位，用竹签挑取少许粪便大约半个米粒的量，让粪粒和生理盐水充分混合并在载玻片上均匀的涂抹成一层粪膜，置显微镜下观察[5]。此法检测需注意的是滴加生理盐水的量视粪便的稀稠情况而定。为了提高检出率，可取不同部位的检查结果是阴性的粪便标本复查3次。本法用于检测大小鼠，豚鼠等实验动物肠道鞭毛虫和纤毛虫的检测。
2.2.2 直接涂片染色法 主要为碘液染色法，即，于載玻片中央滴加一滴碘液，用竹签挑取少许粪便，在碘液中均匀地涂抹一层粪膜，加盖玻片在显微镜下检查。此法适用于犬、猴溶组织内阿米巴包囊、结肠内阿米巴包囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊等原虫包囊的检测，显微镜下检测到包囊即可判为阳性。
2.3 厚涂片透明法（thick smear method）
又称加藤法（Kato’ method）。用4cm大的正方形的100目/吋筛网过筛粪便后，取50mg粪样放在载玻片上，用一张浸透的甘油-孔雀绿溶液的玻璃纸片盖在载玻片上并轻压，这样粪便能铺开成为一个涂面。置于30～36℃环境中30min，或置于25℃环境中约60min。待粪膜稍干，透明即可镜检[6]。该法主要用于蠕虫卵的检查。
2.4 沉淀集卵法
2.4.1 自然沉淀集卵法（nature sedimentation method） 取粪便25g，放入烧杯内，加入10～20倍的蒸馏水，调成粪浆。用双层湿纱布将粪浆滤入500mL锥形量杯中，加蒸馏水至500mL静置20～30min。先废弃上清液，然后加蒸馏水反复沉淀2～3次后，直到上清液变澄清，再弃去上清液，取沉渣涂片镜检。
2.4.2 离心沉淀法[7]（centrifugal sedimentation method） 取2g粪便充分搅碎调匀，加蒸馏水5mL用湿纱布滤入离心管中，平衡离心管离心粪样（1500r/min）然后弃去上清液，再加蒸馏水重复离心沉淀3～4次，直至上清液澄清后，废弃上清液，取沉渣涂片镜检。
2.4.3 醛醚沉淀法（formalin-ether sedimentation） 把粪便中加入SAF保存液中混匀，用纱布过滤，离心（2000r/min）1min后，吸去上清液，然后加入7mL生理盐水并用木筷混匀，混匀后加入3mL乙醚盖上盖子，拇指按住盖子充分混匀，不能拔掉盖子（小心气体）。离心（2000r/min）5min，废弃上面的3层，吸取底层滴在载玻片上涂抹均匀，盖上盖玻片后镜检。
2.4.4 尼龙袋集卵法（nylon pocket egg concentration method） 取铜丝筛（80孔/时，筛径10cm，深4cm）与尼龙袋（260孔/时，筛径12cm，深10cm）套迭，铜丝筛在上，尼龙袋在下。将粪便加水调匀后倒入铜丝筛内，滤去粗大的粪渣，粪液滤入尼龙袋内，然后取去铜丝筛，将尼龙袋依次浸入2只盛清水的器皿内用光滑圆头玻璃棒反复搅拌袋内粪便（注意不使袋内粪渣外溢）直至袋内包囊杂质全部淘洗干净，再用清水冲洗袋内壁四周使粪渣集中于底部，可直接吸取粪渣涂片镜检。此法主要用于血吸虫虫卵的浓集[8]。
2.5 浮聚法（floatation method）
2.5.1 饱和盐水浮聚法（brine floatation method） 该法检测钩虫卵效果比较好。用竹签挑取黄豆大小的粪便放入漂浮杯中，加少量饱和生理盐水，用竹签充分搅成粪浆，然后丢弃竹签。用滴管继续滴加饱和生理盐水，盐水滴加至杯口，但不能溢出。用一块载玻片附着于液滴表面，使两者完全接触静置15min，平提载玻片，迅速反转，放在显微镜下观察。选择比重较饱和盐水更大的亚硝酸钠饱和溶液作为漂浮液更有助于线虫卵的检查。此法适用于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴的蠕虫卵的检测[9]。
2.5.2 硫酸锌离心浮聚法（zinc sulfate centrifugal flotation method） 取少许粪便加入大于粪便10倍量的蒸馏水中充分将粪便搅碎后过滤（过滤方法同离心沉淀法），反复离心3～4次至上清液澄清后，倒去上清液。在粪沉渣中加入33%硫酸锌溶液混匀，然后继续加硫酸锌溶液加到距管口1cm处，再离心1min。用一根接种环挑取表面的粪液置于载玻片上，加一滴碘液镜检，放在显微镜下检查。
2.5.3 蔗糖离心浮聚法（sucrose centrifugal flotation method） 取粪便约5g，加水20mL，以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液3000r/min离心[10] 5～10min，吸弃上清液，加蔗糖溶液再离心，然后如同饱和盐水浮聚法，取其表面膜镜检[11]。鉴于1小时后卵囊脱水变形不易辨认，故应立即镜检。此法适用于检查粪便中隐孢子虫卵囊。
2.5.4 氯化锌溶液漂浮法 取黄豆粒大小的粪便一块放入5mL离心管中，加入4mL氯化锌溶液（氯化锌13.5g+蒸馏水至1000mL溶解后备用）混匀。2000r/min离心3min，静置5min。取1滴上清夜滴于载玻片，盖上盖玻片镜检虫卵。此法比较适用于犬，猫等动物细粒棘球绦虫的检测[12]。
2.6 幼虫孵化法
2.6.1 毛蚴孵化法（Miracidium hatching method） 此法是诊断日本血吸虫及华睾吸虫的方法之一。取30g新鲜粪便，处理方法同自然沉淀法，在烧瓶内放入已经洗净的粪渣，加清水或氨水至烧瓶瓶口处，放25～30℃培养箱或室温孵化，2h后多次观察有无毛蚴孵出。如果有毛蚴孵出，在瓶口水面下可见梭状白色小点做直线运动。毛蚴孵化法又可改良为常规沉孵法和棉析毛蚴孵化法这两种方法[13]。
2.6.1.1 常规沉孵法（conventional sedimentation and hatching method） 又称沉孵法。取粪便100g左右，放入500mL的烧杯中，将粪便加水调至糊状，然后加水至300～400mL，混匀，用50目的粪筛过滤到另一个烧杯内，加水沉淀，静置约20min后弃去上清液，再加水混匀，继续沉淀。就这样反复3～4次后直至上清液澄清为止。最后弃去上清液，将上述沉淀粪渣加温水置于三角烧杯中，杯内的水量至杯口2cm处为宜且使玻璃管中有一段露出的水柱，瓶口用中央插有玻璃管的胶塞塞上，开始孵化。30min后开始观察水柱内是否有毛蚴；若无，以后每隔1h观察一次。直到发现毛蚴为止，才能停止观察。
2.6.1.2 棉析毛蚴孵化法（cotton screening and hatching method） 简称棉析法。取新鲜的粪便50g左右漂洗后，将粪渣放入300mL的平底孵化瓶中，加入25℃的清水到瓶颈下部，为了使瓶颈下部不浮动，可以在液面上方塞一层薄的脱脂棉，再缓慢加入温水至瓶口1～3cm处。如棉花层上面水中有粪便浮动，可将这部分水吸去，再加清水孵化。这种方法比较简便只需漂洗或不漂洗直接装瓶孵化。毛蚴只集中在棉层上方的清水域中与下层粪液隔开，这样有利于毛蚴的观察。
2.6.2 钩蚴培养法（Ancylostome culture method） 此法主要用于检查钩虫卵。取15mL的洁净试管1支，加入蒸馏水1～2mL，将滤纸剪成与试管等宽但较试管稍短的T字形纸条，取约黄豆大小粪便均匀地涂抹在竖条纸的2/3处，将纸条插入试管内，使下端刚刚与水接触；以粪便不接触水面为宜；在25～30℃培养箱孵育。3d后（注：需每天补充蒸发的水分），用肉眼或放大镜观察管底水中有无钩蚴。无色透明的钩蚴在水中经常蛇形游动，虫体透明。如果没有发现钩蚴，则需要继续培养观察至第5天才能结束。
2.7 幼虫分离法-贝尔曼法（Baermann，stechnique）
该方法用于从粪便和土壤中查找蠕虫的幼虫。贝尔曼装置是由一个大的玻璃漏斗及其周围的竖立成环形的支撑结构所构成。漏斗下端连接乳胶橡皮管子，管子有塞子。漏斗内安置一个金属筛片用作样品支撑。使用时在样品1～3cm的水平之上装满大约30℃的水，铺设一层纱布于支撑的筛片上，放入5～15g粪便残渣并确保被温水覆盖。静置过夜后，放一块载玻片或培养皿在橡皮管下面，打开塞子使液体流入载玻片上面，盖上盖玻片，置显微镜下检查幼虫。
2.8 幼虫培养法（LarvaL cuLture method）
取新鲜易碎的粪便若干，置培氏皿中央堆成半球状，顶部略高出，然后在培氏皿内边缘加水少许，粪便不能太干燥（稀的粪便可不用加水）。为了使粪与培养皿接触必须加盖盖好。放入25～30℃的培养箱内培养[14]。（夏天放室温亦可）每日观察粪便是否干燥，要保持适宜的湿度，加水定期培养。经7～15d，第三期幼虫即可出现，它们从粪便中爬出来，在此期间全部幼虫应该已经达到感染期。幼虫爬到培氏皿的盖上或四周。这时可用吸管吸上生理盐水把幼虫冲洗下来，滴在载玻片上，覆以盖玻片，进行镜检。
2.9 肛門拭子法（anaL swab method）
2.9.1 透明胶带法（ceLLophane tape method） 用于检测蛲虫卵。雌性的蛲虫从肛门周围的皮肤上产卵。蛲虫卵通常在常规的粪检中不能看到。因此可以用2cm宽的透明胶带剪成3～6cm长的小段，粘贴肛门周围，然后拿下并粘在载玻片上，置显微镜下检查。此法也适用于检测小鼠蛲虫（隐藏管状线虫）卵和大鼠蛲虫（大鼠管状线虫）卵。
2.9.2 棉签拭子法（cotton swab method） 用长10～11cm的竹签，一端包以脱脂棉将它放在生理盐水中浸湿，然后挤去多余水分，将此棉签放在试管内，盖上纱布防尘落内，用时取出。将棉签放肛周皱襞表面顺一个方向滚动揩拭。然后将棉签放入试管内并在试管的1/2处加入饱和盐水并用力振荡数分钟，然后，迅速将棉签提起来并将棉签放在试管壁上。挤去多余的水分，弃之。试管内加满饱和盐水静置20min后，用盖玻片轻轻地沾试管口液面，迅速取下，盖于载玻片上镜检[15]。
2.10 粪便寄生虫定量的病原学检查方法
2.10.1 定量透明法（Kato-Kaze method） 又称改良加藤法，适用于各种粪便内蠕虫卵的检查和计数。经4cm大的正方形的100目/吋筛网筛过的粪便填满置于载玻片上的定量板的模孔，刮去多余粪便，拿掉定量板，盖以浸透的甘油—孔雀绿溶液的玻璃纸片并轻压，使粪便铺开成一个涂面。置30～36℃环境中30min，也可以25℃约60min。待粪膜稍干，透明即可镜检。由于填满定量板的粪量为41.7mg，将虫卵数乘24，再乘粪便性状系数，即为每克粪便虫卵数。
2.10.2 汞碘醛离心沉淀法（merthioLate-iodine-formaLdehyde centrifugation sedimentation method） 把1g粪便加入到10mL左右的汞碘醛液中，充分混匀，用两层脱脂纱布过滤，然后在加入乙醚4mL，混匀2min后离心（2000r/min）1～2min。离心后分成4层。弃去乙醚、粪渣、汞碘醛、这上面3层。取第4层沉渣镜检[16]。包囊浓集可以提高检出率。此法可用来进行蠕虫卵的定量检测，前提必须是粪便量要准确到1g。
2.10.3 简易计数法（simpLe counting method） 该法只适用于线虫卵和球虫卵囊计数。取新鲜的粪便1g，置于小烧杯中，加10倍量水搅拌混合，用纱布滤入离心管中，静置30～60min（或离心沉淀2～3min）弃去上层液体后加饱和盐水，混匀后用滴管滴加盐水至离心管口，管口上方用正方形盖玻片覆盖[17]。经30min取下盖玻片，放在载玻片上镜检。分别计算各种线虫卵的数量。每份粪便用同样方法复查3片，其总和为1g粪便的虫卵数。
2.10.4 麦克马斯特氏法（McMaster’s method） 麦氏法用于确定每克粪便的卵或卵囊的数量最简单和最有效的方法。称量4g粪便放入容器中，加入56mL饱和盐水充分振荡、混匀、搅拌，通过细筛过滤于另一容器中，用巴氏吸管吸出样品，填满麦克马斯特计数池的两侧。放置5min，置10×10的放大倍率下进行显微镜检查，计数所有的卵或卵囊。两个计数池虫卵数加在一起，乘以50就是每克粪便中的虫卵数。
2.10.5 斯陶尔氏法（StoLL’s method） 用下颈部有两个刻度的小烧瓶下面刻度为56mL，上面刻度为60mL，（没有这种烧瓶，可用事先标好上述二个刻度的大试管或小三角烧杯代替）。计数时，先加入4% NaOH到下面的刻度处，再缓慢加入捣碎的粪便，使液面到达上面的刻度60mL为止（大约加入4g粪便）。然后再加十几粒小玻璃球，充分振荡，使液体成为分布均匀的粪悬液，经过滤后，用吸管吸取滤液0.15mL置载玻片上，盖上大的盖玻片镜检计数。或将0.15mL粪液滴于2～3张载玻片上，分别进行计数，再加起来即可。所见虫卵总数×100，就是每克粪便中的虫卵数。需要注意的是做虫卵计数时，粪便应无任何杂物，必须将粪便彻底研碎，混匀。在进行虫卵计数时，最好每天早、中、晚各检查一次并连续检查3次，然后取其平均值，这样取得的虫卵计数结果比较准确。将每克粪便虫卵数×24h粪便的总重量，计算结果就是每天所排虫卵总数，再将此总数除以已知成虫每天排卵数，可以得出雌虫的大约寄生数量。如果是雌雄异体的，将上述雌虫数再×2，即可得出雌雄成虫寄生总数。
2.11 寄生虫学测微技术（Micrometry in ParasitoLogy）
在光学显微镜下测量细菌、细胞、寄生虫卵、幼虫、某些成虫、原虫等大小时需要使用显微镜测微器[18]。这个仪器是由目镜测微尺和物镜测微尺两部分组成。使用时，将目镜测微尺放于目镜内，物镜测微尺放在载物台上。用低倍镜调节焦距，使目、物这两个测微尺的零点对齐，再寻找目、物这两个测微尺较远端的另一重合线，算出目镜测微尺的几格相当于物镜测微尺的几格，从而计算出目镜测微尺上每格的长度，以后测量时，只用目镜测微尺测量就可以了。在没有物镜测微尺的情况下，可以用血球计数板代替使用。以计数板内两个小方格的长度为标准，可以按上述方法测出目镜测微尺每1格的微米数。用目镜测微尺测量虫卵大小时，一般是测量虫卵的最长处和最宽处，圆形虫卵是测量其直径；测量幼虫和某些成虫时，是测量虫体的长度、宽度及各部分构造的尺寸大小。各种虫卵和幼虫常有恒定的大小，测量虫卵和幼虫的大小可作为确定某一虫卵或幼虫的依据。注意有些虫体会弯曲，这时候可以采用旋转目镜测微尺的办法，来进行分段测量，最后将数据加起来就行了。
3 小结
上述粪便寄生虫病原学检测方法可操作性强，无需特殊仪器设备，快速省时。有些方法很经典，沿用至今。且经过众多检测人员长时间的积累和改良，实践证明应用范围甚为广泛。但是由于通过形态学进行诊断，某些寄生虫虫卵或幼虫的鉴别受检测人员主观因素影响较大。为了弥补这一不足，有待于运用分子生物学和免疫学等检测技术与传统镜检技术相结合的方式来提高粪便寄生虫虫卵或幼虫的检出率[19]，提高检测效率。
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