一种新型恶性疟原虫和间日疟原虫联合快速检测胶体金试剂盒的性能评价
[摘要] 目的 評价一种新型恶性疟和间日疟联合快速检测胶体金试剂盒的检测性能。 方法 对2001年1月～2016年4月解放军第三〇二医院及协助医院留取的疟原虫感染患者及其他发热患者全血样本345例，分别采用疟原虫免疫胶体金法与显微镜检法进行疟原虫检测，以显微镜检法结果为金标准评价免疫胶体金快速检测试剂的灵敏度、特异度和一致性。 结果 发热患者中血涂片镜检法检出疟原虫感染204例，快速检测胶体金试剂盒检出疟原虫感染207例。其中恶性疟原虫免疫胶体金法检出111例，显微镜检法检出112例，灵敏度为99.11%，特异度为100.00%，两种方法一致性检验Kappa值为0.993，两种检测结果具有很好的一致性。间日疟原虫免疫胶体金法检测出96例，显微镜检法检出92例，灵敏度为100.00%，特异度为98.42%，两种方法的一致性检验Kappa值0.971，两种检测结果具有很好的一致性。 结论 新型快速检测试剂盒疟原虫抗体免疫胶体金法与显微镜检法结果具有较好的一致性，且具有操作简便、快速、无需专业仪器和专门技术人员等优点，适合于临床实验室疟疾的辅助诊断和筛查。
[关键词] 疟原虫；免疫胶体金法；显微镜检法；性能评价
[中图分类号] R531.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（a）-0004-04
Performance evaluation of a plasmodium falciparum and plasmodium vivax malaria joint colloidal-gold rapid detection kit
HE Yeli ZHAO Xiaoru ZHAO Lili SHEN Yan LI Bo MAO Yuanli LI Bo"an WANG Han
Center for Clinical Laboratory， 302 Military Hospital of PLA Clinical Laboratory Diagnosis Center for Infectious Diseases of Military， Beijing 100039， China
[Abstract] Objective To evaluate the performance of a plasmodium falciparum and plasmodium vivax joint colloidal-gold rapid detection kit. Methods 345 blood samples from patients with fever which included malaria parasite infection ones， collected from 302 Military hospital of PLA and its cooperative hospital from January 2001 to April 2016， were included in this study. According to microscopy which was used as the gold standard， the sensitivity， specificity and consistency of colloidal-gold rapid detection kit by immune colloidal gold method were calculated. Results Totally， plasmodium were detected in 204 samples by microscopy， while 207 samples were detected by immune colloidal gold method. Plasmodium falciparum were detected in 112 samples by microscopy， and 111 samples were detected by immune colloidal gold method. Accordingly， the sensitivity and specificity were 99.11% and 100.00% respectively. The consistency check value of Kappa of the two methods was 0.993， indicating the two methods had good consistency. For plasmodium vivax dectection， 96 samples were positive by immune colloidal gold method， while 92 were positive for that by microscopy. And the sensitivity and specificity were 100.00% and 98.42% respectively. The Kappa value was 0.971， indicating the two methods also had good consistency. Conclusion The two methods of immune colloidal gold method and microscopy method have good consistency. And the new rapid detection method by immune colloidal gold has the advantages of simple operation， rapid， no need of professional instrument and special technical personnel. It is suitable for clinical laboratory diagnosis and screening of malaria.
[Key words] Plasmodium； Immune colloidal gold method； Microscopy； Performance evaluation
疟疾是一种严重威害人类健康的感染性寄生虫病。世界卫生组织（WHO）报告，截至2015年9月，全球疟疾患者总数为21 400万例，死亡4.38万例[1]。2015年全国共计报告疟疾病例3116例。全球约33亿人受到疟疾的威胁，给全球尤其是发展中国家带来了严重的健康危害和经济负担[2-3]。
疟原虫是引起疟疾的病原体，主要包括4种：恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫。疟原虫感染多数发生在热带和亚热带地区，在我国以恶性疟原虫和间日疟原虫为主[4]，多发生在华中和华南地区，但在全国31个省份均有病例报告[5]。由于我国经济发展，尤其与非洲和南美洲等疟疾的高发地区经济往来不断增长，输入性病例成为我国疟疾病例的重要特点。2015年疟疾病例98%以上为境外输入性病例，且较2014年有所增加。
疟疾尚无有效疫苗[6]，我国法定为乙类传染病。若发生症状24 h内不采取对症治疗，疟疾会严重威胁生命造成死亡。目前我国和大多数发展中国家仍以显微镜镜检为主要检测方法但该检测方法需要具有经验的检验技术人员，且受主观因素影响较大易漏诊[7-8]，因此快速、准确的检测尤为重要。为此，笔者以恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白Ⅱ（Histidine-rich protein Ⅱ，HRP-Ⅱ）和疟原虫乳酸脱氢酶（plasmodium lactatedehy-diogenase，PLDH）作为主要靶抗原，研制了一种新型快速检测试剂盒，以提高恶性疟和间日疟的早诊率、治疗有效率，降低病死率。本文对该新型免疫胶体金法试剂盒进行性能评价，以探讨其临床应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2001年1月～2016年4月解放军第三〇二医院（以下简称“我院”）及协助医院（云南省寄生虫病防治所、云南省昆明市疾病预防控制中心）留取的疟原虫感染患者及其他发热患者全血样本345份，其中，疟疾患者204例，年龄22～65岁，平均（43.5±17.2）岁，男118例，女86例；不明原因发热患者141例，年龄10～69岁，平均（39.5±17.2）岁，男85例，女56例。
1.1.1 临床诊断 对发热患者345例诊断分析，主要以疟疾（59.13%）、尿路感染（11.88%）和败血症（7.25%）为主，其次为出血热（4.93%）、肝胆病感染（4.35%）等其他疾病发热患者。见表1。
1.1.2 临床症状 疟原虫感染患者均可出现不同程度的临床症状或伴随重叠临床表现，热型呈不规则型，主要以发热（99.02%）、寒战畏寒（88.73%）和乏力纳差（63.24%）为主要临床症状表现。见表2。
1.2 方法
1.2.1 免疫胶体金法 采用我院临床检验医学中心研制的快速检测胶体金诊断试剂盒，以抗恶性疟原虫特有的HRP-Ⅱ抗体和PLDH抗体作为检测抗体，检测患者血液中的HRP-Ⅱ和PLDH。将疟原虫胶体金检测试剂取出放室温平衡，采用吸管吸取5 μL新鲜抗凝管全血样本或末梢血静脉样本，滴入样本孔，在稀释液孔滴加3～4滴稀释液，待稀释液渗透至膜底部，室温放置，要求15 min内判读结果。如标本中含有疟疾特异性抗原，将与预标记的抗体反应形成复合物，在层析作用下，被预先固定在膜上的疟疾特异性抗体捕获，C为试验控制线，T1为恶性疟原虫检测线，T2为间日疟原虫检测线，根据说明书要求，出现T1检测线或T1+T2线为恶性疟原虫感染或混合感染，单独出现T2检测线为间日疟原虫感染，C线未出现判为试验无效。
1.2.2 显微镜检法 采集患者静脉血2 mL到抗凝管中或取末梢血1～2滴制作厚薄血涂片，选择优质推片进行血涂片准备，推片边缘整齐、平滑，使用前以弱酸溶液浸泡24 h以上，再用蒸馏水彻底清洗表面游离碱质，干燥后备用；载玻片参数推荐厚1.0～1.2 mm，面积25.4 mm×76.2 mm；制备血涂片时以推片醮取血液少许，置于载玻片右端1/3处，接触载玻片至血液扩散成均匀线型，并保证推片与载玻片角度为30°～45°，均匀前推直至玻片尾部即载玻片左侧1/6处。制片要求厚薄适宜、体尾平均、边缘整齐，且血细胞分布均匀，占载玻片总面积的2/3；晾干后薄血膜用分析纯甲醇固定，待再次晾干后，用吉姆萨染色液染色15～20 min后油镜检测疟原虫。吉姆萨染色液由珠海贝索生物技术有限公司生产，生产批号为[415093]；显微镜选择日本OLYMPUS公司CX21型生物显微镜，低倍镜下可见核浆分明为宜，厚血膜需要由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2 cm的圆形，厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个WBC为宜[4-5]。检测全部厚血膜，未查见疟原虫，或者最少检测100个薄血膜油镜视野，未查见疟原虫为阴性。观察到疟原虫环状体、滋养体、裂殖体、配子体即为阳性，并鉴定虫种。疟原虫形态学诊断依据《全国临床检验操作规程》（第3版）。
1.3 观察指标
以显微镜镜检法结果为准，对免疫膠体金快速检测结果进行评价。①灵敏度又称真阳性率，即实际患病而按该验证方法的标准被正确判断为患病的百分比，反映对照方法确定患病能力。②特异度又称真阴性率，即实际未患病按该方法被正确地判断为未患病的百分比，反映验证方法确定非患病能力。③一致率又称符合率，即验证方法判定结果与对照方法诊断结果相同例数占总受检例数比例。④Kappa系数，反映验证方法与对照方法结果的一致性[9]。
2 结果
345份疑似患者标本胶体金快速检测检出恶性疟原虫111份，显微镜检检出112份，灵敏度为99.11%，特异度为100.00%，Kappa值为0.993（表3）。胶体金快速检测检出间日疟原虫96份，显微镜检检出92份，灵敏度为100.00%，特异度为98.42%，Kappa值为0.971（表4）。免疫胶体金法共计检出阳性标本207份，显微镜检法共计检出阳性标本204例，灵敏度为99.51%，特异度为97.16%，总符合率为98.55%，Kappa值为0.970，免疫胶体金法与显微镜检法具有高度的一致性。选取4例不同胶体金快速检测结果见图1，显微镜检法混合感染疟疾环状体和裂殖体见图2。
测试卡1为混合疟原虫测试卡2为恶性疟原虫感染患者测试阳性结果；测试卡3为间日疟原虫感染患者测试阳性结果；测试卡4为阴性检测结果
3 讨论
疟疾的早期诊断和治疗，可以减少疟疾的危害[9-10]。疟原虫感染准确快速诊断已被列为世界卫生组织疟疾防治重要对策之一[12]。目前针对疟原虫的检测主要有显微镜检法、PCR扩增法、环介导等温扩增和免疫层析技术等[13]。显微镜检法是目前疟原虫检测的金标准，具有费用低、仪器简单且不受环境限制等优点，但容易受虫密度含量较低和镜检人员技术高要求时产生较大漏诊[14]，此外镜检人员因眼睛疲劳也会导致读片准确性和工作效率降低。血片质量以沉渣、厚薄和酸碱性使镜检结果产生较高误诊率[15]。PCR擴增法和环介导等温扩增等分子生物学，虽然准确度、灵敏度均很高，但技术复杂、成本高，需要具备一定的实验室条件和一定经验的技术人员，操作时间长，很难实现现场和快速检测[16]。免疫层析法则具有操作简单、快速、无需特殊仪器、不受环境、条件限制等优点。
目前我国临床实验室使用的快速检测疟疾主要依赖国外进口，如CareStart疟疾HRP-Ⅱ/PL.DH复合快速诊断试剂盒，可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫，检测靶物为HRPⅡ和PLDH，但其检测成本昂贵，不利于筛查和基层实验室使用。胶体金快速检测试剂的检测灵敏度和特异性也存在一定差异，在我国已经获得SFDA认证的快速诊断试剂仅有一家，难以满足国内检测需求[17]。随着我国经济贸易和文化交流的不断推进，赴非洲和东南亚等疟疾高发地区的务工人员不断增加，使输入性疟疾病例呈现上升趋势[18]，研制低成本、高灵敏度和特异性的国产检测疟疾试剂盒，将有利于滇、贵、川及边远山区的基层实验室、赴不发达国家任务执行以及各传染病和疾病预防控制中心临床实验室的常规使用和筛查。
我院是全国最大和全军唯一的传染病专科医院，担负日常传染病收治、会诊以及反恐和公共卫生事件的应急处置等任务，每年接收大量不明原因发热的患者。我院临床检验医学中心结合各传染病医院和疾病预防控制中心，通过大样本对一种疟原虫抗体胶体金联合快速检测试剂盒的性能进行评价。本课题前期通过特异性HRP-Ⅱ和PLDH作为主要靶抗原，成功表达恶性疟原虫抗原HRP-Ⅱ和间日疟原虫抗原PLDH，制备检测抗体。利用侧向层析的彩色乳胶微球的致敏技术以及应用于侧向层析的链霉亲和素-生物素信号放大技术，创建了一种新型疟原虫抗体胶体金快速检测试剂盒。免疫胶体金法最低检测出量为50～200个疟原虫/微升血（含550万～600万红细胞），显微镜检法最低检出限3～4个/万红细胞[19-20]，敏感性高于显微镜检法，使得快速检测试剂比传统快速诊断试剂提高灵敏度5～10倍。根据临床诊断结果和镜检法结果分析，免疫胶体金快速检测试剂盒诊断疟原虫感染结果显示灵敏度为99.51%、特异度为97.16%，符合率为98.55%，Kappa值为0.970，与显微镜检法结果高度一致。与国外CareStart疟疾HRP-Ⅱ/PL.DH复合快速诊断试剂盒的灵敏度和特异度为89.68%和98.26%[17]非常接近，同时高于国内某品牌P.f/P.v检测试剂盒的灵敏度和特异度为92.56%和98.57%[17]，性能评价较好，符合实验室诊断要求。
综上所述，该新型恶性疟原虫和间日疟原虫联合快速检测胶体金试剂盒具有很好的灵敏度和特异性，可以作为显微镜检法替代方法，为基层医疗机构和大规模普查提供疟疾的诊断依据，同样非常适用于维和任务、野外环境快速检测等使用，为早期发现疟疾患者，提高临床治疗疗效提供重要手段。
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（收稿日期：2016-09-02 本文编辑：程 铭）