均匀设计在酿酒酵母电转化条件研究中的应用

摘要：电穿孔方法是一种高效导入外源DNA的技术。通过电转化法对酵母YPH 500进行外源DNA转化，研究了电转化中各因素对酵母转化率的影响。结果表明，电场强度、外源DNA浓度、感受态细胞状态对转化率有明显影响。采用均匀设计试验，利用逐步回归方法对试验结果进行分析， 结果表明，当电场强度在1 750 V，酵母OD 600 nm在1.3，外源DNA浓度为7.5 mg/L时，酵母转化率较高，约为24×102转化子数/μg DNA。

关键词：电转化；酿酒酵母；均匀设计

中图分类号：Q785；S963.32+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0693-04

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种模式生物，常常作为表达系统。近些年，研究者常利用它进行外源基因的表达或其他基因操作技术，所以外源基因的导入是进行试验的先决条件。20世纪80年代，研究者开始利用电转化法将外源DNA导入酵母细胞，该方法现已成为常用方法[1，2]。在转化时，试验结果往往受感受态细胞状态、外源DNA浓度、电场强度等多个条件的影响，需要探索最佳电转化率的条件。但其中涉及多因素、多水平的试验，常规探索性试验工作量较大。均匀设计具有试验次数少，信息量大的优点，只需做少量试验，建立数学模型，就可得到最佳的配比。本试验将穿梭质粒通过电转化到酿酒酵母YPH 500中，从中考察电场强度、外源DNA浓度和酵母细胞不同的生长状态下3个因素对电转化的影响，以期为酿酒酵母电转化的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 菌种和质粒 酿酒酵母YPH 500（遗传背景：MATα ura3-52 lys2-801anber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、穿梭质粒pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Carol S. Newlon教授赠送。

1.1.2 培养基 YPD培养基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖（固体培养基琼脂含量1.5%）。SD筛选培养基：1.34%YNB，2%葡萄糖，2%琼脂，氨基酸（ade、ure、trp、his、lys，均为20 mg/L），SD全营养培养基：在SD筛选培养基的基础上加100 mg/L leu。

1.1.3 试剂与主要仪器 1 mol/L山梨醇（南京博尔迪生物科技有限公司）；DP103型小提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。2510型电转仪、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；722型可见光分光光度计（上海驰唐电子有限公司）；紫外分光光度计（美国Merinton公司）；光学显微镜[OLYMPUS（中国）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母YPH 500生长曲线的测定 将冻存菌种在YPD固体培养基上划线，30 ℃培养3～4 d。立即挑取单菌落接种于含有100 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、180 r/min培养。每隔2 h取样测定OD600 nm值，同时通过细胞计数板计数。绘制酵母菌生长曲线。

1.2.2 外源DNA的制备 在穿梭质粒pRS405上搭载酵母ARS304片段，导入大肠杆菌DH5α中储存。采用DP103型小提试剂盒提取pRS405- ARS304质粒。将所得产物用紫外分光光度计测量质粒含量。

1.2.3 感受态细胞的制备 挑取活化好的酵母单菌落接种于含有50 mL YPD液体培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃ 180 r/min培养。将培养好的细胞冰上放置10 min，倒入50 mL离心管中，4 ℃、1 300 r/min离心5 min。去掉培养液，用50 mL预冷的无菌水将菌体沉淀重悬，重复此步骤，洗涤2遍。再加入10 mL冰冷的1 mol/L山梨醇重悬菌体。最后加入1 mL冰冷的1 mol/L山梨醇。

1.2.4 电转化单因素验证 将制备好的不同时期感受态细胞、外源DNA分别混匀进行以下处理，电转化体系均为60 μL。①外源DNA 浓度5.0 mg/L，取不同感受态细胞的OD600 nm（0.2、0.4、0.7、1.1、1.3、1.4、1.5）进行处理，感受态细胞用量80 μL，电场强度1 500 V；②感受态细胞OD600 nm为 1.1，用量为80 μL，取不同外源DNA浓度（0.25、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/L ）进行处理，电场强度1 500 V；③感受态细胞OD600 nm 为1.1，外源DNA浓度5.0 mg/L，取不同电场强度（600、900、1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 V）进行处理。将反应液在冰上加入到空管中混匀，转移到电转杯中进行电转化。

1.2.5 电转化均匀试验 确定所要研究的感受态细胞状态、外源DNA浓度、电场强度3个因素的不同水平，根据均匀设计[2]进行试验，试验因素和水平见表1。

1.2.6 电转化效果评价 将转化产物加入1 mol/L 冰冷的山梨醇溶液中进行洗涤。高速离心5 s去部分上清，轻柔混匀后涂布于SD筛选培养基上。每个试验3次重复，其中对照组分别涂布于SD 筛选培养基和SD全营养培养基上。30 ℃培养4 d，统计平板菌落个数。计算转化率，评价每组试验效果[3]，其定义如下：

转化率=转化子/外源DNA量×稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 外源DNA的制备

将酵母YPH 500中的ARS304片段进行克隆，通过 BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切后搭载于穿梭质粒pRS405上形成pRS405-ARS，该质粒结构如图1所示。

在转化时，环状质粒线性化便于整合到宿主细胞基因组中从而提高转化率[4]。pRS405作为穿梭质粒，在一定条件下可以带ARS304自由穿梭于原核生物和真核生物中，ARS（Autonomously replicating sequence）为酵母染色质复制所依赖的顺式作用元件，ARS序列可提高导入质粒的复制活性，减少质粒丢失率，同时少部分可整合到基因组中并随基因组复制，所以目的基因不需要线性化。该质粒携带有亮氨酸基因，可在亮氨酸缺陷性酵母菌株中筛选。

2.2 酵母YPH 500生长曲线的测定

由酵母YPH 500细胞数量和OD600 nm可以看出（图2），在30 ℃、180 r/min的条件下培养，酵母YPH 500在16～26 h可达到对数期，其OD600 nm为0.2～1.5，酵母YPH 500数量约为3.86×1011～5.04×1012个/mL。其中在28 h之后酵母数量与OD600 nm没有相关性。

2.3 酵母YPH 500不同的生长状态对电转化效果的影响

酵母菌生长状态对转化率的影响主要是由于分裂时酵母细胞壁的结构发生变化[5]。在电压1 500 V、外源DNA浓度5.0 mg/L的条件下，取处于不同阶段（OD600 nm为0.2～1.5）的酵母YPH 500感受态细胞80 μL进行电转化。通过统计发现，不同阶段的感受态细胞对转化率的影响差异较大，在对数初期和对数末期效率较低，是由于在初期菌量较少，外源DNA进入细胞的概率较小，而在对数末期其细胞壁较为致密不利于电穿孔。所以酵母菌生长状态主要受2个因素控制，即细胞数和细胞壁的结构。其中OD600 nm为1.3时的酵母YPH 500细胞电转化率最高，达到19.5×102转化子数/μg DNA（图3）。

2.4 外源DNA浓度对酵母电转化效果的影响

在电压为1 500 V，感受态细胞OD600 nm为1.1，用量为80 μL的条件下，分别加入不同浓度的外源DNA进行电转化。结果如图4所示，当外源DNA浓度在7.5 mg/L时转化率最高，但在2.5～10.0 mg/L 的范围内其转化率差异较小。当外源DNA浓度较少时，有效电击会减少[6]，而当量多时反应原理尚未弄清。有研究者猜想[7]可能是由于DNA较多时，会对细胞表面点位造成影响或者是由于堵塞转化孔道所致。当外源DNA量低于2.5 mg/L或高于10.0 mg/L时其转化率明显下降。本试验中，外源DNA在一定范围内（2.5～10.0 mg/L）酵母电转化率变化不大，而超出此范围，转化率则明显减少。

2.5 电场强度对酵母电转化效果的影响

采用1 mm宽度的电转化杯，在OD600 nm为1.1的感受态细胞，用量为80 μL，外源DNA 浓度5.0 mg/L的条件下，分别施以不同的电压进行电转化，结果如图5所示。在不同电压下酵母转化率差异较大，其中在电场强度为1 500 V时转化率最高，1 800 V时次之，当电场强度大于1 800 V时，会造成细胞形成难以自愈的较大孔道，细胞内大分子容易溢出，造成细胞死亡，转化率下降。而当电场强度过小时，在细胞表面形成的孔道较小，外源DNA难以进入，使转化率降低。在本试验中电场强度对酵母转化率的影响较为明显，其阈值范围较小（1 500～1 800 V），超出此范围，酵母转化率明显降低。

2.6 均匀设计试验结果

为进一步探讨电场强度、外源DNA浓度、感受态细胞状态3个参数及其交互作用对酵母电转化率的影响，以转化率为考核指标进行优化试验。优化试验结果见表2。

利用SPSS 17.0数据处理软件对试验数据进行回归分析处理，得到转化率与各因素的回归方程为：Y=321.4+46.75X1-32.54X2-12.9X3-26.151X12+103.48X22+1 343.5X32。其中相关系数R为0.999 9，F值为987，作F 检验，F>F0.05（8，1）=238.9，回归方程显著。将试验中的数据通过回归方程进行预测，结果如表3所示，观测值与拟合值误差较小，准确度高。通过单因素分析，其通径系数为X1（0.827 6）>X3（-0.364 9）>X2（-0.283 4）。在3个参数中，感受态细胞状态对酵母转化率的影响最大，电场强度次之，外源DNA浓度最小。通过对回归方程进行极值分析，发现酵母感受态细胞OD600 nm为1.3，电场强度为1 750 V，外源DNA浓度为7.5 mg/L时可得到较高的电转化效率，约为24×102转化子数/μg DNA。

3 小结与讨论

本试验通过电场强度、外源DNA浓度、感受态细胞状态进行单因素试验，发现各因素对酵母电转化率的影响较大，其中酵母感受态细胞OD600 nm达到1.3，电场强度达1 500～1 800V，DNA浓度达到7.5 mg/L时可在各自水平中取得较好的试验结果。

对以上3个因素进行均匀设计，研究各因素的交互作用对酵母转化率的影响，发现3个因素对酵母转化率的影响各不相同，感受态细胞状态影响最大，电场强度次之，外源DNA浓度最小。通过对回归方程的极值运算，可预测酵母感受态细胞OD600 nm达到1.3，电场强度达到1 750 V，外源DNA浓度达到7.5 mg/L时可得到较高的电转化效率。本研究结果表明电转化效率的条件优化利用均匀设计试验简单、可信度较高。如果加入其他条件的研究，将大大降低试验组数，节省试验材料。

参考文献：

[1] HASHIMOTO H， MORIJAWA H， YAMATA Y， et al. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA[J]. Applied Microbiol Biotechnol，1985， 21（5）：336-339.

[2] 方开泰.均匀设计与均匀设计表[M].北京：科学出版社，1994. 13-17.

[3] 刘秀莲，王宇光，雷禄旺. 海洋红酵母电转化条件的研究[J].生命科学研究，2008，12（2）：136-140.

[4] 秦玉静，金建玲，鲍晓明，等.影响酿酒酵母电击转化率的条件[J]. 山东大学学报（自然科学版），1999，34（2）：236-240.

[5] BECHER D M， GUARENTE L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation[J]. Methods Enzymol，1991，194：182-187.

[6] MEIHOC E， MASSON J M， TEISSIE J. High efficiency transformation of intact yeast cellls by electric field pulses[J].Biotechnol，1990，8：223-227.

[7] HICKS J B， HINNEN A， FINK G P. Properties of Yeast Transformation[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1978.

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