花生酱和饼干中大肠菌群检测方法的灵敏度研究
摘 要：目的：研究花生酱和饼干中大肠菌群检验方法检出率的灵敏度。方法：对103份花生酱样品进行三种方法的大肠菌群检测。结果：103份花生酱样品中，2003版阳性率13.6%，2016版MPN法阳性率16.5%，2016版平板法阳性率17.4%；80份饼干样品中，2003版阳性率15.0%，16版MPN法和平板法阳性率均16.3%。数据上表明2016版检测方法灵敏度略高于2003版。
关键词：大肠菌群；MPN计数法；平板计数法
Abstract：Objective： To study the sensitivity of the detection rate of coliform bacteria in peanut butter and biscuits. Methods： A total of 103 samples of peanut butter were tested for coliform bacteria. Results： Among the 103 samples of peanut butter， the positive rate was 13.6% in 2003， the positive rate was 20.5%， the positive rate was 16.0% in 2016， and the positive rate was 16.4% in 16 plates. And the positive rate of plate method was 16.3%. The data show that the sensitivity of the 2016 version of the detection method is slightly higher than the 2003 version.
Key words：Coliform bacteria； MPN counting method； Plate counting method
中图分类号：TS207.3
大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌和产气克雷伯氏菌等。大肠菌群是食品检测中的重要指示菌，与肠道致病菌具有相同的生长环境，其能够在肠道中存在和繁殖，在粪便中存在的数目比肠道致病菌高，能够比较直接地反映食品被粪便污染的程度。
花生醬[1]和饼干[2]的大肠菌群限量标准，至多
30个/100 g，分别于2016年3月1日和2016年9月22日调整为2015版的三级采样方案n=5，c=2，m=10，M=100。即5个样品中，允许5个样品中大肠菌群检验值不大于10 CFU/g，允许有至多2个样品的大肠菌群检验值在10～100 CFU/g，不允许有样品的大肠菌群检验值大于100 CFU/g[3]。对大肠菌群的检测方法分为三种：
GB/T 4789.3-2013MPN计数法、GB 4789.3-2016MPN计数法和平板计数法。本篇旨在研究三种大肠菌群检验方法检出率的灵敏性。
1 材料与方法
1.1 实验样品
花生酱样品103份；饼干样品80份。
1.2 培养基与试剂
乳糖胆盐发酵培养基；伊红美蓝琼脂（EMB）；革兰氏染色液；乳糖发酵培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）；煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；无菌生理盐水。
仪器：恒温培养箱；恒温水浴锅；天平；拍打式均质器；超净工作台。
1.3 实验方法
（1）GB/T 4789.3-2003《食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》[4]：选择3个连续稀释度，每个稀释度接种3个乳糖胆盐发酵管，36 ℃恒温培养24 h，观察产气情况。如有产气，转种在伊红美蓝琼脂平板，36 ℃恒温培养24 h。伊红美蓝琼脂平板上挑取可疑菌落进行革兰氏染色并接种乳糖发酵管，36 ℃恒温培养24 h，观察产气情况。
（2）GB 4789.3-2016《食品安全国窖标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[5]第一法：大肠菌群MPN计数法：选择3个连续稀释度，每个稀释度接种3管LST，36 ℃恒温培养24 h，观察产气情况。如有产气，用接种环取产气的LST培养物1环，转种BGLB肉汤，36 ℃恒温培养48 h，观察产气情况。
（3）GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》第二法：大肠菌群平板计数法：选择2个连续稀释度，每个稀释度2个无菌平皿，每皿1 mL。将20 mL 46 ℃的VRBA倾倒每个平皿，旋转混匀，凝固后加3 mL VRBA覆盖，凝固后翻转36 ℃恒温培养24 h。计数典型可疑大肠菌群菌落，挑取移种到BGLB肉汤管内，36 ℃恒温培养24～48 h，观察产气。
2 结果与分析
2.1 花生酱中大肠菌群的检测结果
可以看出，103份花生酱样品中，2003版方法检出大肠菌群阳性样品14份，阳性率13.6%；从表2可以看出，2016版MPN法检出大肠菌群阳性样品17份，阳性率16.5%，2016版平板法检出大肠菌群阳性样品18份，阳性率17.4%，三种方法检出的大肠菌群阳性率差值最大为3.8%，限量指标的替换并未对不合格率产生较大影响，这和舒静[6]等的研究结果相近。2003版检测结果换算下单位为MPN/g即：2.9、1.1、0.3、0.4、1.6、1.9、0.6、0.7、0.3、0.9、1.1、0.6、1.6、1.6，从数值上看低于2016版MPN检测值。
2.2 饼干中大肠菌群的检测结果
2003版方法检测饼干中大肠菌群的结果见表3。
可以看出，80份饼干样品中，2003版检出大肠菌群阳性样品12份，阳性率15.0%，从表4可以看出，2016版MPN法和平板法均检出大肠菌群阳性样品13份，阳性率16.3%，三种方法检出的大肠菌群阳性率差值最大为1.3%，限量指标的替换并未对不合格率产生较大影响。2003版检测结果换算下单位为MPN/g即：0.4、0.4、2.4、1.1、0.9、1.5、0.6、1.2、0.6、0.9、0.7、0.3，数值上低于2016版MPN检测值。
3 结论
两种MPN法相比较：2003版初发酵培养基为乳糖胆盐培养基，2016版初发酵培养基为月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基，胆盐和月桂基硫酸盐的作用都是抑制革兰氏阳性菌，胆盐是生物试剂，批间差异大，月桂基硫酸盐为化学试剂阴离子表面活性剂[7]，批间差异小，对损伤菌有修复作用但不受酸碱性的影响。乳糖胆盐发酵管中含有溴甲酚紫指示剂[8]，遇酸变成黄色，当大肠菌群分解乳糖产酸产气时，试管中培养基由紫色变成黄色，如果当溶液颜色发生变化但不易判断是否产气时，也需要进一步做验证实验。但2016版杜氏管判断产气比2003版要简单，从实验得出的数据表明，2003版MPN法较2016版MPN法灵敏度低，这和刘耕典[9]等的研究结果相近。
2016版两种方法相比较：液体培养基理论上比固体培养基的增菌和修复效果要好，但LST法比平板法的检出率略低，MPN计数法是一个区间值，通过查表得到的数值是这个区间范围内的最大可能值。例如花生酱12号样品产气管数101，查表得出MPN值为7.2 MPN/g，MPN区间值为1.3～18 MPN/g，由于10 MPN/g是其中一个指标值，表明该样品虽检测结果为合格，但也存在不合格的可能性；相反，也会有不合格样品被当作合格的可能性。平板法为定量检测值，检测结果为10 MPN/g，在1.3～18内，表明平板法比LST法数值相对准确，但两种方法在大肠菌群的检测中仍有一致性，这和郭晓焕等的研究结果相近。
MPN即最大概率值，是基于泊松分布的一种间接计数法，这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。MPN最大可能数法已经成为大肠菌群、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和阪崎肠杆菌等多种项目的技术方法。MPN是利用多个连续稀释度，每个稀释度有多个平行发酵管进行实验，通过其结果阳性管数分布情况，查MPN表从而得出报告结果的一种计数方式。应用MPN计数时，应注意菌液稀释度的选择要合适。MPN计数法存在一定的局限性，主要表现在平衡性和重现性不佳，相同MPN值不一定可信限相同，相同可信限MPN值也不一定相同，数值不连续。
平板法为准确定量值，操作较简便，带有菌落的平板可以计数，可以观察菌落特征，可见的菌落与大肠菌群量直接对应，得出定量结果，缺点是因我们的肉眼无法通过平板直接观察大肠菌群的数量，所以还需利用放大镜进行准确辨认，并从中挑取菌落进行验证。验证实验菌落的挑选会导致假阴性结果。
通过三种方法检测大肠菌群，进行对比研究，结果表明2003版方法灵敏度较2016版方法低，2016版两种方法在大肠菌群检测中具有一致性，检测方法的不同和限量指标的替换并不影响不合格率。
参考文献：
[1]中华人民共和国国家和计划生育委员会.GB 19300-2014 食品安全国家标准 坚果与籽类食品[S].北京：中国标准出版社，2013.
[2]中华人民共和国国家和计划生育委员会.GB 7100-2015 食品安全国家标准 饼干[S].北京：中国标准出版社，2015.
[3]中华人民共和国国家和计划生育委员会.GB 4789.1-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则[S].北京：中国标准出版社，2016.
[4]中华人民共和国国家和计划生育委员会.GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定[S].北京：中国标准出版社，2003.
[5]中华人民共和国国家和计划生育委员会.GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数[S].北京：中国标准出版社，2016.
[6]舒 静，李宏梁，刘耕典，等.冰淇淋大肠菌群测定方法与现行指标值关系[J].食品研究与开发，2016（3）：166-169.
[7]闫 颖.2种国标方法测定大肠菌群的比较研究[J].预防医学论坛，2015（12）：943-944，949.
[8]鄭 婕，丁洪强，曹利蓉，等.食品大肠菌群MPN检验方法探析[J].疾病预防控制通报，2012（6）：80-81.
[9]刘耕典，李宏梁，舒 静，等.GB 4789.3-2010 MPN法适合酱腌菜大肠菌群现行指标的研究[J].中国调味品，2016（1）：117-120.