兔支气管败血波氏杆菌不同感染途径研究
摘要 用兔支气管败血波氏杆菌分离株BJL0504菌株（I相菌）经滴鼻、肺内、气管、静脉、皮下对30~ 40日龄兔攻毒，并进行临床观察和微生物学检查，比较不同攻毒方法的优势。结果显示，经静脉注射的家兔发病率和死亡率高，症状较典型；经肺内注射也可以引起部分发病和死亡；滴鼻和气管注射感染均可以复制到典型的临床症状，但是解剖病变都不明显。由此可见，支气管败血波氏杆菌经静脉攻毒可以较好的复制病例，这对支气管败血波氏杆菌的致病机理的研究、疫苗的研制和评价提供了理论基础。
关键词 兔；支气管败血波氏杆菌；感染途径
中图分类号 S858.2916.3 文献标识码A文章编号11007-5739（2008）18-0235-03
支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）也称支气管鲍特杆菌或博德特氏杆菌，是引起多种哺乳动物呼吸道疾病的主要病原菌之一，广泛感染家畜、野生动物和实验动物上呼吸道，能引起猪、马、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠等哺乳动物的呼吸道疾病[1，2]，常导致感染动物发生鼻炎和支气管肺炎。该菌常存在于家兔上呼吸道黏膜，在气候骤变的秋冬之交极易诱发此病。这主要是由于家兔受体内、外各种不良因素的刺激，抵抗力下降，导致该菌得以侵入机体内而引起发病[3]。在兔群中感染率非常高，并常与巴氏杆菌、葡萄球菌等混合感染[4，5]，引起严重的呼吸道疾病。本文通过不同途径使家兔感染支气管败血波氏杆菌，比较不同感染途径的优势，以期对该菌的致病机理进行进一步的研究。
1材料和方法
1.1支气管败血波氏杆菌菌株
支气管败血波氏杆菌菌株BJL0504分离于鼻炎发病兔，由江苏省农业科学院兔病与兽医生物技术项目组分离鉴定并冻干保存。
1.2试验动物
21只30~40日龄健康兔由南京军区南京总医院比较医学科提供。将购入的健康试验兔隔离观察3d，每天观察精神状态、是否有鼻炎、打喷嚏等症状，无异常情况后再采集鼻拭子涂布麦康凯平板和绵羊血鲍姜氏平板，同时采集血液分离血清。鼻拭子未分离到支气管败血波氏杆菌、血清与标准菌株玻片凝集试验阴性的兔可以进行人工感染试验。
1.3主要试剂
绵羊血采自江苏省农科院兽医所；鲍姜氏培养基、麦康凯培养基购于广东环凯微生物科技有限公司；马丁肉汤由南京天邦生物科技有限公司制作。
1.4菌株复苏、培养
复苏冻干保存的支气管败血波氏杆菌BJL0504于马丁肉汤，37℃，190rpm振荡培养16h，经平板菌落计数法进行细菌计数后使用。
1.5动物分组及处理
采用静脉、滴鼻、肺内、气管和皮下多点注射5种攻毒方式，设立空白对照组和无菌马丁肉汤肺内感染接种对照组，共7组，家兔3只/组。将滴鼻攻毒组与其他各组隔离饲养。
1.6攻菌方式和剂量
采用静脉、滴鼻、肺内、气管和皮下多点注射的攻毒方式，对家兔进行感染攻毒试验，各攻毒BJL0504菌株菌液1mL，菌数约为7.7×109cfu/mL。
1.7临床观察及细菌检测
每天多次观察家兔的精神状态、食欲、饮欲和发病后的临床症状等，并详细记录发病及死亡情况。发现死亡的家兔立即进行剖检，并无菌从死亡兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠系膜淋巴结、气管做细菌分离检测。未死亡的家兔观察14d后，耳缘静脉注射空气致死，剖解观察病变并无菌从致死兔肝脏、心脏、肺脏用绵羊血鲍姜氏平板进行细菌分离检测，37℃培养72h后做最后判定。
2结果
2.1临床症状
2.1.1静脉感染兔临床症状。静脉感染家兔后20h左右，兔出现呼吸困难，张口呼吸，鼻腔以及鼻周围有些潮湿，精神萎靡不振，24h之内食欲、饮欲废绝，约27h后死亡1只，另2只在48h之内死亡。
2.1.2滴鼻感染兔临床症状。滴鼻感染家兔后几分钟，兔出现嗤鼻现象，频率较高，之后稍有减缓，24h之内食欲、饮欲基本废绝，之后逐渐恢复，48h后出现鼻液增多，并见有白色水样鼻液流出，60h观察时鼻液变浓，呈米黄色，患兔出现抓鼻，打喷嚏现象，滴鼻后第4天鼻液黏稠，色黄（图1），但感染后的14d观察期内没有发生死亡。
2.1.3肺内感染兔临床症状。肺内感染家兔十几分钟后，兔出现嗤鼻现象，24h之内食欲、饮欲基本废绝，之后饮欲稍有恢复，但是精神沉郁，不喜运动，于48h左右死亡1只。其余2只在感染后的14d观察期内没有发生死亡，精神状态也逐渐转好，没有发现可见的临床症状。
2.1.4气管感染兔临床症状。气管攻毒家兔十几分钟后，兔出现嗤鼻现象，24h之内食欲、饮欲基本废绝，之后饮欲稍有恢复，但是精神沉郁，不喜运动，48h后产生白色水样鼻液，并观察到患兔出现抓鼻、打喷嚏现象，之后几天鼻腔内流出的鼻液由水样逐渐变为黏液样甚至脓性淡黄色或白色，有的患兔在鼻腔周围形成鼻液的结痂。感染后的14d观察期内没有发生死亡。
2.1.5皮下多点注射感染兔临床症状。皮下多点注射感染家兔后48h左右，注射点处发生溃烂，流出乳白色脓性、黏性分泌物，兔精神基本正常，6d后溃疡处结痂、变硬，轻轻揭开部分结痂可见下面基本出现正常皮肤。感染后的14d观察期内没有发生死亡。
2.1.6对照组临床症状。2个对照组在14d观察期内均没有观察到明显的临床症状，食欲、饮欲和精神状态均较好，也没有发生死亡。
2.2解剖病变
2.2.1静脉感染兔解剖病变。气管：黏膜常见充血和小点出血，黏膜面上附有灰黄色浆液性分泌物（图2）。肺脏：坏死且有出血斑，表面有绿豆至黄豆大脓包，肺组织实变，沉于水底（图3）。心脏：心包膜增厚，与胸腔壁粘联，很难剥离。心肌柔软，心腔扩张（图4）。肝脏：有坏死点，表面增生1层白色的假膜（图5）。肾脏：多数病变不明显。部分病例的肾中度肿大，质地柔软，皮质和髓质交界处瘀血（图6）。脾脏：萎缩，变脆，表面有出血点（图7）。
2.2.2滴鼻感染兔解剖病变。观察14d后，将未死亡的兔经耳缘静脉注射空气致死，剖检未见有明显的特征性解剖病变。
2.2.3肺内感染兔解剖病变。除见到同静脉感染死亡兔相同的解剖病变之外，肺内感染死亡兔胸腔内有红色混浊的胸腔积液（图8），14d观察期内未死亡兔在解剖后也发现有少量胸腔积液。
2.2.4气管感染兔解剖病变。观察14d后，将未死亡的兔经耳缘静脉注射空气致死，剖检未见有明显的特征性解剖病变。
2.2.5皮下多点注射感染兔解剖病变。观察14d后，将未死亡的兔经耳缘静脉注射空气致死，剖检未见有明显的特征性解剖病变。
2.2.6对照组解剖病变。观察14d后，将对照组兔经耳缘静脉注射空气致死，剖检未见有明显的解剖病变。
2.3细菌分离情况
无菌从死亡兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠系膜淋巴结、气管做细菌分离，结果均分离到形态单一的菌落，经鉴定为攻击的支气管败血波氏杆菌；观察14d后未死亡兔经耳缘静脉注射空气致死，并对致死兔心脏、肝脏、肺脏做细菌分离检测，肺内感染未死亡的2只兔于肺脏均分离到攻击的支气管败血波氏杆菌，其余各组攻毒兔和对照组兔这3种脏器均未分离到任何细菌。滴鼻感染兔致死前使用无菌鼻拭子于鼻腔进行细菌分离，也分离到攻击的支气管败血波氏杆菌。
3讨论
不同途径感染家兔，静脉注射的家兔发病率和死亡率高；肺内注射也可以引起部分兔发病和死亡；滴鼻感染能复制到典型的临床症状，但是解剖症状不明显；气管注射感染的家兔也表现出明显的临床症状，解剖病变亦不明显，与佟承刚等报道基本一致[6]，但他们的研究中静脉和滴鼻攻毒都没有发生明显的临床症状和病理变化，这些不同可能是由于Bb培养和增殖等过程中菌落发生变异、感染菌量、感染兔龄和兔的免疫状态有差异而引起的；皮下多点注射感染的家兔，注射48h左右注射点出现皮肤坏死区，与兽医微生物学报道的一致[2]。空白对照组在14d观察期内没有发现可见的临床症状和解剖病变，说明在观察期内除滴鼻组之外的各组家兔之间没有发生相互感染；无菌马丁肉汤肺内感染接种对照组在14d观察期内没有发现可见的临床症状和解剖病变，说明肺内注射无菌马丁肉汤对该方法的攻毒效果基本没有影响。
本菌在临床上主要感染30~40日龄的幼兔，因为此时母源抗体滴度基本达到最低[7]，并造成持续感染，或带菌感染但不发病，成为支气管败血波氏杆菌主要的传染源，但是在外界环境变化时，动物抵抗力降低，上呼吸道黏膜对该菌的敏感性增强，容易引起发病，所以在进行本试验时选用30~ 40日龄的幼兔作为人工感染的实验动物模型。
本病剖检病变主要是肺部发生实变、肉变和坏死，气管出血，心胞膜增厚、粘连以及肝脏的坏死，与王启明等报道的基本一致[8]。急性临床症状表现为败血症，往往感染后2d左右，甚至24 h即死亡，而且该菌极易与多杀性巴氏杆菌、葡萄球菌等混合感染。佟承刚等还从鼻炎病兔分离到绿脓杆菌、奇异变形杆菌、金色葡萄球菌和白色葡萄球菌、脑膜炎脓毒杆菌等几种细菌[9]，由于感染支气管败血波氏杆菌后使得机体免疫力下降[10]，更容易引发其他细菌的混合感染，导致更为严重的烈性细菌病，给兔群带来严重的危害并造成巨大的经济损失，所以对支气管败血波氏杆菌的研究应该引起足够的重视。
本研究证实了支气管败血波氏杆菌经静脉攻毒可以致死家兔并可以较好的复制病例，为研究支气管败血波氏杆菌的致病机制以及疫苗的研制和评价等打下了基础。
4参考文献
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