自制泡菜中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定
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摘 要：试验以自制泡菜为原料，通过平板涂布、划线分离、革兰氏染色和接触酶试验得到3株乳酸菌，经过16S rDNA序列分析鉴定，3株菌株分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）2株和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermeutum）1株，并对其胞外多糖产量进行测定，筛选出产胞外多糖含量最高的菌株。分离出的高产胞外多糖乳酸菌，可为研究、开发新型功能性食品提供原料，并为后续胞外多糖的工业化制备提供理论依据及数据支持。
关键词：泡菜;胞外多糖;筛选;鉴定
Abstract：Three strains of lactic acid bacteria were obtained from kimchi flavor raw material by plate coating， scribed separation， Gram staining and contact enzyme test. After 16S rDNA sequence analysis， three strains were identified as Lactobacillus plantarum （2 strains） and Lactobacillus fermeutum （1 strain）， and their extracellular polysaccharide production was determined， and extracellular polysaccharide production was screened out，the strain with the highest polysaccharide content. The lactic acid bacteria with high yield of extracellular polysaccharides can provide raw materials for the research and development of new functional foods and provide theoretical basis and data support for the industrial preparation of extracellular polysaccharides.
Key words：Pickles; Extracellular polysaccharides; Screening; Identification
中图分类号：TS201.3
多糖类化合物是由微生物代谢产生的，广泛存在于微生物、植物及动物机体当中[1]，可参与细胞的代谢、转化、分裂及免疫调节等生理过程[2]。它具有良好的生物活性，具有降血糖、调节血压、调节机体的免疫功能等作用，广泛应用于医药行业[3]。乳酸菌胞外多糖不仅具有保健功能，還可作为安全、天然的添加剂，可赋予产品良好的口感、风味和质地[4-5]。近年来，胞外多糖已成为乳酸菌资源开发利用的研究热点。
泡菜是以萝卜、卷心菜、白菜等为原料，浸渍在低浓度的盐水中，在乳酸菌的作用下，经7～10天发酵而成的一类蔬菜制品，因质地脆嫩和风味独特而深受消费者的青睐[6]。泡菜主要是靠乳酸菌发酵生成大量乳酸来抑制腐败微生物，从而达到长时间贮存的目的。乳酸菌不仅能起到抑菌作用，其在发酵过程中可产生多种物质，从而赋予泡菜特殊的风味。可从泡菜中分离出乳酸菌，并将具有优良发酵特性的乳酸菌分离株应用于泡菜的生产中。本研究旨在从自然发酵的泡菜中筛选出高产胞外多糖的乳酸菌菌株，通过形态观察，结合分子生物学方法对其进行鉴定，从而丰富产胞外多糖乳酸菌发酵剂的种类。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
泡菜为饭店的自制泡菜。95%乙醇、三氯乙酸、苯酚及浓硫酸等：均为国产分析纯试剂;细菌基因组提取试剂盒：天根生化科技有限（北京）有限公司;MRS培养基;MRS-CaCO3培养基。
超净工作台;立式高压灭菌锅;电热恒温培养箱;厌氧操作箱;电显微镜;2720 PCR扩增仪，3730-XL测序仪及5415R冷冻离心机。
1.2 实验方法
1.2.1 样品中乳酸菌的分离纯化
厌氧操作。称取适量泡菜汤汁，用0.9%（W/W）的生理盐水对其进行梯度稀释，将样品稀释为10-4、10-5、10-63个稀释度，分别吸取3个稀释度的稀释液0.1 mL，涂布于MRS-CaCO3培养基平板上，每个稀释度重复3次，37 ℃下恒温培养24～48 h，观察并记录菌落特征，挑取具有乳酸菌典型特征并伴有溶钙圈的菌落，进行反复划线纯化，直至出现单个纯菌落，并对纯化菌株进行革兰氏染色、接触酶试验。
1.2.2 产胞外多糖乳酸菌的筛选
将纯化得到的菌株再次接种于MRS培养基中，37 ℃培养箱中培养48 h。用无菌接种环挑取表面粘稠并有明显拉丝的单菌落，观察菌落的特征：形态、大小、表面光滑程度、菌面隆起程度及菌落边缘的整齐程度。对该菌株的纯培养物进行革兰氏染色，在显微镜下观察其细胞形态特征。
1.2.3 16S rDNA基因序列分析
（1）DNA的提取。按说明书，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述纯化菌落的基因组DNA。
（2）16S rDNA基因序列的测定。对提取的基因组进行PCR扩增，引物为（5"-AACGCGAAGAACCTTAC-3"）和（5"-CGGTGTGTACAAGACCC-3"）。PCR反应体系：引物各1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，MgCl2 4 μL，Taq酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，用dd H2O补至50 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环30次，最后一次循环中72 ℃下延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR扩增产物送往山西兆恩因生物公司进行DNA测序。
（3）同源性分析。将测序结果做Blast分析。根据GenBank中提供的基因序列，采用Mega软件中的邻接法构建系统发育树。
1.2.4 胞外多糖产量测定
将筛选得到的乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h，取培养液加80%三氯乙酸至终浓度为10%，充分搅拌，4 ℃、16 000 r·min-1离心20 min，收集上清液。在上清液中加3倍体积的95%的乙醇，沉淀过夜。4 ℃、16 000 r·min-1下离心20 min，收集沉淀并用蒸馏水溶解，装入透析袋，透析48 h，得胞外粗多糖水溶液。采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。
2 结果与分析
2.1 产胞外多糖菌株的筛选
将筛选出的菌株分离纯化后进行革兰氏染色、接触酶实验，将革兰氏阳性且接触酶实验呈阴性的菌株初步确定为乳酸菌。如图1，菌落呈圆形、乳白色、不透明、表面凸起、光滑湿润且粘稠且边缘整齐[7]。菌株因可产生胞外多糖，从而使菌落粘稠且可以拉丝[8]。
进一步筛选粘稠并拉丝的菌落。结果从泡菜中共分离出3株产胞外多糖的乳酸菌，如图2，在光学显微镜下，3菌株均为革兰氏阳性菌，呈短杆状，单独或成对存在，无芽孢[7]，标记为M1～M3。
2.2 产胞外多糖菌株株16S rDNA序列分析
提取3株菌株的基因组DNA，经PCR扩增后测序，根据GenBank中提供的基因序列，依据16S rDNA序列构建进化树进行分析，M1、M2与Lactobacillus plantarum的相似度为99%，因此鉴定为植物乳杆菌;M3与标准菌株Lactobacillus fermeutum的相似度为100%，因此将其鉴定为发酵乳杆菌。
2.3 胞外多糖产量测定
培养3株菌株，提取胞外多糖，计算不同菌株的胞外多糖产量。如图3所示，3株菌株的胞外多糖产量均在200 mg·L-1以上，其中M2菌株即植物乳杆菌的胞外多糖产量最高，为351 mg·L-1。
3 结论
本研究以饭店自制的泡菜为原料，从中挑选高产胞外多糖的乳酸菌株，经过分子生物学鉴定，该菌株为植物乳杆菌。近年来，乳酸菌胞外多糖已成为研究和开发产胞外多糖的细菌的热点之一[9]。本实验筛选出的高产胞外多糖M2菌株，为进一步开发利用乳酸菌菌种资源奠定了一定的理论基础[10]。
参考文献：
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