豆粕有机质发酵液发酵条件的优化

材料和方法

1.1 材料

豆粕有机质：南亚热带作物研究所，本实验室保存。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL。

菌株：香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense Snyder & Hansen，简称为Foc）为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，中国热带农业科学院海口实验站/香蕉研究所，曾会才课题组提供。

仪器：振荡器、摇床、三角瓶、涂玻棒、无菌操作台、酒精灯、离心管、离心机、PCR仪等。

1.2 方法

1.2.1 影响因素的筛选

豆粕有机质磨碎，加水配制成1 g/mL的混悬液，按照不同的发酵方法分别进行发酵，发酵之后，取发酵液稀释至10倍，备用。取Foc4菌丝块（以下称“靶标菌株”）接入PDA培养基平板中间，所得的豆粕发酵液接种在距靶标菌株菌丝块2～3 cm处的四周，28℃培养1～2 d，每个处理设置3次重复，计算抑菌带宽度的平均值。

抑制率%=（对照菌直径-处理菌直径）/（对照菌直径-菌饼直径）。

数据采用和统计软件进行方差分析及多重比较。

1.2.2 豆粕有机质浓度的选择

豆粕有机质分别稀释至2、4、5、8、10、15倍，按照1.2.1的方法进行发酵，并测定不同稀释浓度的豆粕有机质发酵后抑菌带的宽度。比较豆粕有机质浓度对豆粕有机质发酵液抑菌效果的影响。

1.2.3 发酵基质的选择

在豆粕有机质混悬液分别加入蔗糖、红糖、麸皮、椰糠、玉米粉，按照1.2.1的方法进行发酵，并测定抑菌带宽度。考察不同发酵基质对豆粕有机质发酵液抑菌效果的影响。

1.2.4 发酵基质浓度的选择

根据1.2.1筛选出的基质，分别设定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL 6个不同的浓度，按照1.2.1的方法进行发酵，并测定抑菌带宽度。考察不同的基质浓度对发酵液抑菌作用的影响。

1.2.5 发酵时间的选择

根据1.2.1筛选出的基质，按照1.2.1的方法进行发酵，并在第1、3、5、10、15、17 d取发酵液，分别测定其抑菌带宽度。考察发酵时间对发酵液抑菌作用的影响。

1.2.6 发酵条件的优化

根据单因素的实验结果，选择豆粕有机质浓度、发酵基质浓度和发酵时间为考察因素，每个因素设置低、中、高水平进行正交试验，分别测定各豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度。各因素水平如表1。

2 结果与分析

2.1 豆粕有机质浓度对发酵液抑菌效果的影响

随着豆粕有机质稀释倍数的增加，豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度呈先上升后降低的趋势，稀释5倍的抑菌带宽度达到最大值。不同稀释倍数的豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度如图1。

2.2 不同发酵基质对发酵液抑菌效果的影响

通过在豆粕有机质混悬液中添加不同发酵基质，豆粕有机质发酵液的抑菌效果有不同程度的提高，抑菌带宽度均有所增加，其中添加了红糖的豆粕有机质发酵液抑菌效果最好，结果如表2。因此，本实验中选择红糖作为发酵基质。

2.3 发酵基质浓度对发酵液抑菌效果的影响

随着豆粕有机质混悬液中红糖浓度的增加，豆粕有机质发酵液的抑菌效果逐渐增强，并在2.5 g/mL之后趋于稳定。

2.4 发酵天数对发酵液抑菌效果的影响

随着发酵天数的增加，豆粕有机质发酵液的抑菌带宽度呈先上升后下降的趋势，并且在发酵第15 d时达到最大值，结果如图3。

2.5 正交试验对发酵条件的优化

根据单因素的试验结果，选择L9（34）正交表安排试验，具体实验如表3。

通过对正交试验的结果分析可以看出，各因素对豆粕有机质发酵液抑菌效果影响从大到小依次为：C>B>A，最佳发酵工艺组合为A2B2C2，即豆粕有机质混悬液稀释5倍，红糖浓度为2.0 g/100 mL发酵15 d。

3 讨论

生物防治是目前公认比较安全和有效的防控香蕉枯萎病的措施之一，并符合环保和有机食品要求[10]。有机质饼肥发酵而成的液体肥料能较好的抑制多种病原菌，降低作物的发病率[11]。抑制土传病害需要依赖土壤微生物群体作用，土壤微生物群落结构越丰富、物种越均匀、多样性越高时，抑制病原菌能力越强。豆粕有机质发酵液中微生物，尤其是其中的拮抗菌，是防治香蕉枯萎病的重要因素。而发酵条件对发酵产物中微生物的种类和数量起着决定性作用。本研究通过单因素对影响微生物的多项因素进行筛选，并通过正交试验对豆粕有机质发酵条件进行优化，通过比较不同处理对香蕉枯萎病病菌的抑制作用，得到了豆粕有机质发酵的最优条件，即豆粕有机质混悬液稀释5倍，红糖浓度为2.0 g/100 mL发酵15 d。采用上述条件，发酵所得的豆粕有机质发酵液具有较好的抑菌效果。为豆粕发酵液进行规模化生產提供了数据支持，也为豆粕发酵液大范围应用于香蕉枯萎病的防治提供理论依据。

由于土壤微生物是个非常复杂的系统，仅仅依赖该方法难以充分认识土壤微生物的多样性和复杂性，需要结合分子生物学及其他方法，如可结合基因芯片、稳定同位素探针等技术更深入、全面了解土壤微生物信息。本实验目前只对发酵液进行了平板抑菌实验。因此，进行盆栽苗和大田香蕉植株的防治实验，进一步优化豆粕有机质发酵液的发酵条件，以期形成相对成熟的豆粕有机质发酵方法，从不同角度深入认识土壤微生物多样性变化，阐述其与香蕉枯萎病害发病程度的相互关系，为生态控制土传病害提供技术支撑，以更好地发挥生物防治对香蕉枯萎病的防治效果，探索香蕉枯萎病生物防治的新途径。

参考文献

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