枯草芽孢杆菌SD固体发酵白酒糟工艺研究

材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。供试菌种为枯草芽孢杆菌SD（Bacillus subtilis SD），湖南农业大学生物科学技术学院微生物实验室提供。

1.1.2 主要试剂。葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、NaCl（AR，国药集团化学试剂有限公司）；蛋白胨（BR，广州环凯微生物科技有限公司）；MnSO4·H2O（AR，广州化学试剂厂）；牛肉浸膏（BR，国药集团化学试剂有限公司）。酵母粉、麦麸、沸石粉、豆饼粉均由市场采购所得，无虫蛀和霉变。

1.1.3 主要仪器设备。恒温培养箱（250B，常州市华普达教学仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9070，上海精宏实验设备有限公司）；霉菌培养箱（MJX-160C型，上海博远实业有限公司医疗设备厂）；高压灭菌锅（SS-325，TOMY.KOGYO.CO，LTD）；单人单面超净工作台[SW-CJ-1B（U），苏州设备净化有限公司]；恒温摇床（QYC 2112，上海福玛实验设备有限公司）。

1.1.4 培养基。斜面及平板计数培养基：含NaCl 5.0 g、牛肉浸膏5.0 g、细菌学蛋白胨10.0 g、琼脂15～20 g、水1 000 mL，pH值7.0～7.2。液体种子培养基：含葡萄糖1.5%、豆饼粉1.0%、酵母粉0.5%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 0.2%，pH值7.2～7.5。基础发酵培养基：含白酒糟95%、豆饼粉5%、葡萄糖1.5%、KH2PO4 0.5%、MgSO4·7H2O 0.2%、MnSO4·H2O 0.05%，pH值7.2～7.5，固水比为1.0∶0.7。以上培养基均在121 ℃条件下灭菌25 min。

1.2 试验方法

1.2.1 培养。斜面种子培养：将保存于4 ℃的枯草芽孢杆菌接种于新鲜斜面培养基中，30 ℃恒温培养至成熟，备用。液体种子培养：将培养好的斜面菌种接种于液体种子培养基中，于30 ℃、180 r/min条件下培养24 h，备用。固体发酵培养：按8%（v/w）的接种量将培养好的液体种子接入固体发酵培养基中，35 ℃恒温培养72 h。50 ℃干燥后，测定活菌总数。每处理重复3次。

1.2.2 发酵培养基筛选。分别改变基础发酵培养基中的白酒糟、豆饼粉、葡萄糖、KH2PO4等的添加量，35 ℃恒温培养72 h，50 ℃干燥后，测定发酵物料中的有效活菌数。

1.2.3 发酵条件筛选。改变固体发酵条件，如初始pH值、接种量、菌龄、发酵时间等，35 ℃恒温培养72 h，50 ℃干燥后，测定发酵物料中的有效活菌数。

1.2.4 发酵条件响应面优化。通过单因素试验确定枯草芽孢杆菌发酵白酒糟条件的适宜初始pH值、接种量和菌龄，根据Box-Behnken试验设计原理，以上述3个因素作为自变量，以有效活菌数为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，对枯草芽孢杆菌的发酵白酒糟条件进行优化。响应面设计见表1。

1.2.5 活菌测定。采用平皿活菌计数法，参照文献[14]提供的方法进行。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 白酒糟与豆饼粉比例对活菌数的影响。改变培养基中白酒糟与豆饼粉的比例（89∶11，91∶9，93∶7，95∶5，97∶3），其他条件不变，考察白酒糟与豆饼粉的比例对有效活菌数的影响。从图1可以看出，培养基中随着豆饼粉含量的增加，发酵料中有效活菌数也随之增加。当白酒糟与豆饼粉比例为93∶7时，有效活菌数最大，达8.31×109 cfu/g。但随着白酒糟比例的增加，有效活菌数减少，主要原因是豆饼粉比例减少，降低了培养基中的含氮量，从而影响枯草芽孢杆菌的生长和繁殖。

2.1.2 葡萄糖添加量对活菌数的影响。在培养基中分别加入不同添加量的葡萄糖，其他条件不变，考察葡萄糖添加量对有效活菌数的影响。从图2可以看出，在一定范围内，发酵物料中有效活菌数随着葡萄糖添加量的增加而增加，当葡萄糖添加量为2%时，有效活菌数达1.05×1010 cfu/g。

2.1.3 KH2PO4添加量对活菌数的影响。分别在培养基中加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的KH2PO4，其他条件不变，探讨不同KH2PO4添加量对有效活菌数的影响。磷是微生物细胞中如核酸、核蛋白、磷脂、ATP、辅酶等的重要组成成分。适量的磷，可以促进微生物的生长；但磷过量，可降低微生物对糖的代谢速度而影响微生物的生长繁殖。从图3可以看出，KH2PO4添加量对枯草芽孢杆菌固体发酵白酒糟活菌数有显著影响。当KH2PO4添加量为0.4%时，有效活菌数达到6.92×109 cfu/g。

2.1.4 MgSO4·7H2O添加量对活菌数的影响。改变培养基中MgSO4·7H2O添加量，分别添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，其他条件不变，探讨MgSO4·7H2O添加量对有效活菌数的影响。从图4可以看出，当MgSO4·7H2O添加量为0.15%时，有效活菌数达1.48×109 cfu/g。

2.1.5 初始pH值对活菌数的影响。调节培养基初始pH值为6.6、6.9、7.2、7.5、7.8，其他条件不变，考察培养基初始pH值对有效活菌数的影响。酸碱度主要通过引起细胞膜电荷变化、酶的活性和改变营养物状态和有害物毒性而影响微生物的生长和繁殖。从图5可以看出，当初始pH值为7.2时，活菌数量达到最大值，为1.17×1010 cfu/g。

2.1.6 接种量对活菌数的影响。按4%、6%、8%、10%、12%的接种量分别接入培养好的液体种子，其他条件不变，考察不同接种量对有效活菌数的影响。从图6可以看出，接种量对枯草芽孢杆菌发酵白酒糟的活菌数影响较大，当接种量为10%时，有效活菌数达1.70×1010 cfu/g。但接种量超过10%，有效活菌数下降。原因为接种量小，发酵延滞期延长；接种量大，一方面导致发酵前期营养物质消耗过快，另一方面，过大的接种量也随之带入过量的发酵副产物，从而影响微生物的生长。

2.1.7 种龄对活菌数的影响。分别将培养12、24、36、48、60 h的液体种子接入固体发酵培养基中，其他条件不变，测得有效活菌数结果见图7。可以看出，当种龄为24 h时，活菌数量达最大，为1.58×1010 cfu/g；当种龄大于24 h时，有效活菌数下降明显。主要原因为种龄太大，部分细胞老化或自溶，延长了发酵周期。

2.1.8 发酵时间对活菌数的影响。在上述适宜发酵条件下，于发酵60 h后开始随机取样，以后每隔12 h取样1次，测定有效活菌数，结果见图8。可以看出，随着发酵时间的延长，有效活菌数逐渐增加。当发酵时间为84 h时，有效活菌数达1.75×1010 cfu/g，发酵时间延长，有效活菌数增加不显著。因此，确定发酵时间为84 h。

2.2 固体发酵条件的优化

2.2.1 Box-Behnken试验设计。响应面试验设计和结果见表2。

2.2.2 二次回归拟合及方差分析。以活菌数量（lgN）为响应值，根据表2的试验结果，利用Design Expert 8.0.5b 软件对试验数据进行多元回归分析，得到二次多项式方程：R=10.22+0.073A+0.049B+0.016C+0.063AB+0.003AC+0.045BC-0.174A2-0.137B2-0.082C2。

此模型的方差分析见表3。可以看出，模型P<0.000 1，说明二次回归模型是显著的，失拟项不显著，说明数据中无异常点。相关系数R2=0.993 4，说明二次回归模型能解释99%活菌数量的变化，模型与实际试验拟合程度好，预测值和实际值之间具有高度的相关性，可以应用于枯草芽孢杆菌发酵的理论预测。初始pH值、接种量的一次项和二次项、菌龄的二次项、初始pH值与接种量、接种量与菌龄的交互作用对活菌数量的影响达到极显著水平（P<0.01）。各因素对活菌数量的影响顺序为A2、B2、A>C2>B>AB>BC。

2.2.3 响应面直观分析。利用Design Expert 8.0.5b软件可得到初始pH值、接种量、菌龄3个因素之间的等高线图和相应的响应面分析图。图9、图10、图11分别表示初始pH值、接种量、菌龄3个因素中1个因素取0点时其余2个因素对芽孢数量的影响。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示2个因素交互作用显著，而圆形则与之相反。可以看出，初始pH值与接种量的等高线、初始pH值与菌龄的等高线、接种量与菌龄的等高线都呈椭圆形，说明交互作用显著；3个响应曲面的等高线中心均位于-1～1之间，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内；3个响应面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值（活菌数量）存在极高值。

2.2.4 最适宜的发酵条件。将回归方程分别对各自变量求一阶偏导数并令其为0，可以得到三元一次方程组，对此方程组求解可得到枯草芽孢杆菌发酵白酒糟最适宜的发酵条件，即A=7.28，B=10.18，C=23.85。因此，获得最适宜发酵条件组合为初始pH值7.28、接种量10.18%、菌龄23.85 h、发酵时间84 h，在此条件下有效活菌数理论值为1.75×1010 cfu/g。

2.2.5 模型验证。为了验证模型预测的准确性和有效性，根据响应面试验优化得到的最适宜的发酵条件进行发酵试验，3次重复，得到实际枯草芽孢杆菌发酵白酒糟的活菌数分别为1.76×1010、1.69×1010、1.79×1010 cfu/g，平均活菌数量为1.75×1010 cfu/g。试验值与预测值的相对误差为1.7%，说明试验值与模型预测值拟合良好。

3 结论

通过单因素法确定了枯草芽孢杆菌发酵白酒糟适宜的培养基配方为白酒糟93%、豆饼粉7%、葡萄糖2.0%、KH2PO4 0.4%、MgSO4·7H2O 0.2%、MnSO4·H2O 0.05%、固水比1.0∶0.7。通过响应面法优化枯草芽孢杆菌的固体发酵条件，获得二次回归模型，确定了适宜的发酵条件为初始pH值7.28、接种量10.18%、菌龄23.85 h、发酵时间84 h、培养温度35 ℃。在此条件下，有效活菌数达1.75×1010 cfu/g。

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