龙葵毛状根诱导及其抑菌活性的研究
材料，利用发根农杆菌的遗传转化技术，对龙葵叶片进行毛状根的诱导。并采用纸片法用龙葵毛状根水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌进行抑菌活性试验。[结果]龙葵叶片经农杆菌A4侵染后7 d产生毛状根，毛状根具有多分枝、生长迅速且无向地性等特点，PCR及高压纸电泳检测结果表明Ri质粒的tDNA已整合进毛状根中。相同质量浓度下的龙葵毛状根水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用较强，龙葵毛状根水提物的抑菌效果优于龙葵实生根并具有显著性差异。[结论]龙葵毛状根对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和芽孢杆菌均有一定程度的抑制作用，其药用价值有待进一步研究。
关键词 龙葵；毛状根诱导；水提物；抑菌作用
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-063-03
Abstract [Objective]The aim was to explore the possibility of using hairy roots of Solanum Nigrum L. as new antibacterial agent.[Method] Taking Solanum nigrum L.leaves as experimental material，using the transformation technology of the Agrobacterium rhizogenes， induction of hairy roots of Solanum Nigrum L. was studied.[Result]These findings suggested that hairy roots could be initiated from the cut edges of leaf explants 7 days after inoculation with the strain of A. Rhizogenes A4.The Hairy Roots had the Characters of Much branched， grow rapidly and negative geotropism and so on.The transformation of Ri tDNA was examined through PCR and high voltagepa-pereleetrophoresis. By filter paper method using hairy roots of Solanum nigrum L.and antibacterial activity was tested against Escherichia coli ，Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis，The results indicated that the inhibitory effect to E.coli and Staphylococcus aureus was better than that to Bacillus subtilis at the same mass concentration.The antibacterial effect of Solanum nigrum L. hairy root aqueous extract of Solanum nigrum L.antibacterial effect was better than the real root with the significant differences.[Conclusion] The study provided theoretical basis for the development and utilization of hairy roots of Solanum Nigrum L.
Key words Solanum nigrum L.； induction of hairy roots； Water extracts； Antimicrobial activity
龙葵（Solanum nigrum L. ）植株体内含多种生物碱，如澳洲茄碱、澳洲茄边碱、茄微碱及茄达碱等，全草入药，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和免疫调节等多种药理作用[1-3]，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等均有抑制作用[4]，因此作为植物杀菌剂其应用领域十分广阔。
用发根农杆菌介导出的毛状根通常具有生长迅速、自主生长、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定、分化程度高及不易变异等特点，而且可把二次代谢物分泌至培养基中[5-7]。市场上的中药材80%以上都来自药用植物，其中又有相当一部分来自于植物的根部，因此建立毛状根培养系统对于传统药材的生产方式具重要意义[8]，是大量生产植物有效成分的新途径。
笔者以黑龙江省分布的普通龙葵植株叶片为试验材料，分别进行了毛状根的诱导及对毛状根抑菌活性的研究，探讨龙葵毛状根作为新的抑菌剂的可能性，为龙葵毛状根的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
龙葵叶片取自温室培养的龙葵植株，龙葵毛状根为其诱导所得，对照用龙葵实生根为7、8月份佳木斯大学校园内采集所得。
发根农杆菌菌株A4为佳木斯大学生命科学学院经济植物研究所低温保存，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌株为佳木斯大学生命科学学院微生物学实验室低温保存。
农杆菌菌种活化培养基：YEB培养基，pH 7.0；预培养培养基：MS，pH 5.8；共培养培养基：MS+乙酰丁香酮（AS，200 mg/L）；除菌培养基：MS+400 mg/L头孢噻肟钠+100 mg/L羧苄青霉素，pH 5.8；毛状根继代培养基：MS，pH 5.8。
大肠杆菌及金黄色葡萄球菌培养基：LB培养基，pH 7.4。
1.2 试验方法
1.2.1
外植体的获得。龙葵种子采用常规消毒，于温室内播种于灭菌蛭石中，经60 d培养获得龙葵幼苗，取其幼叶作为外植体进行诱导试验。
1.2.2
菌种的活化。发根农杆菌 A4在无菌条件下接种于YEB 液体培养基内，28 ℃、160 r/min振荡培养24 h，用于外植体侵染。
1.2.3
外植体的转化方法。取龙葵幼叶作为外植体，经常规消毒后切成边长为7～10 mm的小方块，接种于MS培养基预培养2 d，之后将外植体浸入到活化好的菌液中，经5 min后取出，用无菌滤纸吸干多余菌液放置于MS培养基上培养。经共培养2 d后移至除菌培养基进行除菌，每隔5 d转接1次，经反复除菌至培养基农杆菌菌落消失后再转入MS培养基进行继代培养。
1.2.4
龙葵毛状根PCR的检测。
取龙葵无菌毛状根200 mg，用CATB法[9]提取毛状根总DNA，纯化后作为PCR的扩增模板，用CATB法提取未转化龙葵根总DNA作阴性对照，用纯化质粒DNA的提取方法[10] 提取农杆菌质粒作阳性对照。根据Slighton等[11]发表的rolB引物：P1为5′GCTCTTGCAGTGGCTAGATTT3′，P2为5′GAAGGTGCAAGCTACCTCTC3′；rolC引物：P1为5′CTCCTGACATCAAACTCGTC3′，P2为5′TGCTTCGAGTTATGGGTACA3′。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
PCR反应总体系为50 μl。向0.2 ml的硅化离心管中加入模板DNA 1 μl、H2O 34.6 μl、buffer 5 μl、MgCl2 3 μl和dNTP 1 μl，引物P1、P2分别放入2.5 μl、5单位的Taq酶0.4 μl。PCR扩增的反应参数为：94 ℃起始变性3 min，进行35个循环，每个循环包括94 ℃变性1 min，53.5 ℃退火1 min和72 ℃延伸反应1 min，最后72 ℃延伸反应10 min，扩增产物用0.9%的琼脂糖凝胶电泳和EtBr染色进行分析。
1.2.5
龙葵毛状根的抑菌试验。
1.2.5.1
龙葵实生根及龙葵毛状根提取液的制备。取龙葵实生根及龙葵毛状根各10 g，切碎研磨，加50 ml水，浸泡1 h，90 ℃热水提取3 h，过滤。药渣再加水50 ml，90 ℃热水提取3 h，过滤。合并2次滤液，加热蒸发浓缩至10 ml，调节pH至7.4，在121 ℃、0.1 MPa条件下对提取液进行高压蒸汽灭菌20 min，冷却后放入0～4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.5.2
供试菌的活化。
将供试菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，在 37 ℃培养箱中培养 24 h 后备用。
1.2.5.3
菌悬液的制备。将供试菌种放入盛有5 ml无菌水的试管中，无菌操作，振荡摇匀。
1.2.5.4
龙葵实生根及龙葵毛状根提取液的稀释。采用倍比稀释法[12]对龙葵实生根及毛状根提取液进行稀释，稀释后药液质量浓度分别为1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5 g/ml。
1.2.5.5
龙葵实生根及毛状根的抑菌试验。采用滤纸片琼脂扩散法（简称纸片法）[13] 进行抑菌试验，将已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基冷却至50～60 ℃，将其倒入无菌培养皿中，水平放置冷却至凝固。用玻璃涂棒蘸取菌悬液均匀涂抹于培养基上，然后取灭菌后的圆滤纸片（D=5 mm），分别浸没提取液中1 h后取出，将滤纸片上的药液滤干，放置30 s后无药液滴下为宜，将纸片等距贴于琼脂平板上，每皿3片，纸片间的距离均等适中，每一样品重复3次，然后将含菌培养皿放入37 ℃恒温箱中，经倒置培养24 h后取出，用十字交叉法测量抑菌圈直径，取其平均值作为试验结果。体外抑菌定性结果的判定标准：抑菌圈直径在10 mm以下表示不敏感；抑菌圈直径在10～15 mm范围内表示中度敏感；抑菌圈直径在16～20 mm范围内表示高度敏感。以能抑制细菌生长的最低提取物浓度作为该水提物的最低抑菌浓度（MIC值）。
2 结果与分析
2.1 龙葵毛状根诱导培养
发根农杆菌A4侵染龙葵叶片后，叶片逐渐开始出现愈伤组织化，叶片膨胀卷曲，体积可增大到未侵染前的1.5～2.0倍，7 d后从叶片的伤口处陆续产生乳白色的毛状根（图1），诱导出的毛状根具有多分枝、生长迅速且无向地性的特点；未被农杆菌侵染的叶片无上述现象，叶片开始变黄呈死亡状。侵染过的叶片经共培养2 d后移至MS+400 mg/L头孢噻肟钠+100 mg/L羧苄青霉素的培养基上进行除菌培养，每隔5 d更换1次除菌培养基，约35 d叶片周围不再产生菌圈（图2），表明农杆菌已被除去。除菌后的毛状根可在无外源激素的MS培养基上迅速自主生长，将无菌毛状根放入MS液体培养基中进行扩大培养。在初始5～7 d内毛状根生长处于停滞期，7～30 d为生长旺盛期，毛状根经培养不断伸长，可自主生长。
2.2 龙葵毛状根PCR的检测结果
通过对发根农杆菌A4诱导出的毛状根进行PCR检测，转化获得的龙葵毛状根中出现预期的基因条带，未转化的实生根则没有扩增出条带，说明农杆菌A4所含的rol基因已经整合到龙葵的基因组中并得到表达，诱导试验所得到的根是已转化的毛状根。
2.3 龙葵毛状根抑菌试验结果
2.3.1
龙葵毛状根与实生根水提物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。由表1可以看出，金黄色葡萄球菌在浓度高于0.062 5 g/ml时，均出现了抑菌圈，7、8月份龙葵实生根和毛状根的水提物处理最小抑菌圈直径分别为（6.22±0.70）、（6.29±0.63）、（7.81±0.83） mm，最大抑菌圈直径分别为（19.01±1.30）、（18.63±1.22）、（22.94±1.51） mm。
通过差异性分析得出，水提物浓度在高于0.500 0 g/ml时，在同一浓度水平下两种实生根与毛状根之间的抑菌差异显著，而两种实生根之间在同一浓度水平下抑菌差异不显著。
试验结果表明，龙葵毛状根水提取对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于龙葵7、8月份的实生根，龙葵7、8月份实生根的MIC值为0.500 0 g/ml，而龙葵毛状根的MIC值为0.250 0 g/ml。
2.3.2
龙葵毛状根与实生根水提物对大肠杆菌的抑制作用。由表2可以看出，毛状根水提物浓度在0.125 0 g/ml以上开始出现抑菌圈，其最小抑菌圈直径为（7.50±0.68） mm，最大抑菌圈直径为（21.12±1.83） mm，毛状根水提物的MIC值为0.250 0 g/ml。7、8月份龙葵实生根水提物浓度在0. 250 0 g/ml以上时开始出现抑菌圈，最大抑菌圈直径分别为（14.69±1.06）、（14.92±1.02） mm，均比毛状根在同一浓度下的抑菌圈直径要小。
通过差异性分析得出，在同一浓度水平下两种龙葵实生根与毛状根之间的抑菌差异显著，而两种实生根之间在同一浓度水平下抑菌差异不显著。
试验结果表明，龙葵毛状根水提取对大肠杆菌的抑菌效果优于7、8月份龙葵实生根，7、8月份龙葵实生根水提物的MIC值为0.500 0 g/ml，而龙葵毛状根水提物的MIC值为0.250 0 g/ml。
2.3.3
龙葵毛状根与实生根水提物对芽孢杆菌的抑制作用。由表3可得出，龙葵毛状根和7、8月份龙葵实生根3种水提物在浓度0.500 0 g/ml以上开始出现抑菌圈，最小抑菌圈直径分别为（8.56±0.98）、（7.32±0.86）、（6.54±0.66） mm，最大抑菌圈直径分别为（12.74±0.98）、（12.26±1.14）、（11.59±0.66） mm。
经显著性差异分析得出，在同一浓度水平下两种实生根水提物与毛状根水提物之间的抑菌差异不显著。
试验结果表明，龙葵毛状根水提取和龙葵实生根水提物对芽孢杆菌的抑菌效果差异不大，3种根的水提物在浓度为1.000 0 g/ml时芽孢杆菌对其开始敏感，3种水提物的MIC值均为1.000 0 g/ml。
2.3.4
龙葵毛状根对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌抑制作用比较。
由图4可以看出，金黄色葡萄球菌对浓度为0.250 0 g/ml的龙葵毛状根水提物开始表现敏感，抑菌圈直径在所试范围内的最大值为（22.94±1.51） mm，毛状根水提物对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.250 0 g/ml。龙葵毛状根对大肠杆菌的最大抑菌圈直径为（21.12±1.83） mm，其对大肠杆菌的MIC值为0.250 0 g/ml。毛状根水提物浓度为0.125 0和0.250 0 g/ml时，对芽孢杆菌测试均没有出现抑菌圈，浓度为0.500 0 g/ml时开始出现抑菌圈，其对芽孢杆菌的MIC值为1.000 0 g/ml。
3 结论与讨论
采用纸片法和溶液稀释法对龙葵毛状根不同浓度的水提物进行抑菌试验，结果表明，龙葵毛状根的水提物在一定浓度范围内对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和芽孢杆菌均有抑制作用，毛状根的水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于其他两种菌的抑菌效果，并且随水提物质量浓度的增大抑菌圈直径呈上升趋势。
对3种龙葵根的水提物进行抑菌效果显著性差异分析得出，在相同浓度水平下龙葵毛状根与两种龙葵实生根的水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果差异显著。抑菌结果可以看出，大肠杆菌与金黄色葡萄球菌在龙葵毛状根的水提物质量浓度为1.000 0、0.500 0 g/ml时均表现为高度敏感，对质量浓度为0.250 0 g/ml的水提物表现出中度敏感；
毛状根水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值均为0.250 0 g/ml，毛状根水提物对芽孢杆菌的MIC值为1.000 0 g/ml。
龙葵毛状根对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及芽孢杆菌均有一定程度的抑制作用，而对其他菌类抑制作用有待于进一步研究。龙葵毛状根药用价值研究将为开发龙葵功能性食品及相关药物奠定试验及理论基础。毛状根中的组分及其各成分含量对于了解毛状根的作用机理，更好地发挥毛状根在药用价值方面的作用意义较大，这些都有待于进一步研究。
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