结核患者的治疗跟踪及密切接触者的调查研究
打开文本图片集
[摘要] 目的 评价结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）对潜伏性结核诊断及结核患者治疗效果评价的应用价值。方法 选择2012年12月～2014年8月44例治疗后肺结核患者、50例治疗后的肺外结核患者、45例潜伏结核患者（3个月服药后）、92例肺结核病家庭密切接触者、肺外结核患者家庭密切接触者45例、结核病防治工作者31例、88例非结核患者家庭密切接触者，进行外周血T-SPOT.TB检测。 结果 治疗后肺结核患者、治疗后肺外结核患者和潜伏结核患者（3个月服药后）阳性率分别为52.27%、52.00%和55.56%，正常人群阳性率为6.82%，三种类型患者阳性率与正常人群阳性率相比差异均具有统计学意义（P<0.01）；肺结核患者家庭密切接触者、肺外结核患者家庭密切接触者和结核病防治医务工作者的阳性率分别为30.43%、11.11%和19.35%，肺结核患者家庭密切接触者阳性率与正常人群阳性率相比差异具有统计学意义（P<0.01），而肺外结核患者家庭密切接触者和结核病防治医务工作者与正常人群相比差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 酶联免疫斑点 T-SPOT.TB 实验检测结核敏感性强、特异性高，是快速诊断潜伏性结核感染的有效方法，是对结核患者的治疗效果作出评价的有效手段，为结核病的防控提供了一个非常好的监测手段。
[关键词] 结核病；潜伏性结核；结核感染T细胞斑点试验；阳性率
[中图分类号] R521 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）28-0122-04
Tracking treatment of tuberculosis patients and investigation of latent tuberculosis
LIU Chuncheng1 LIU Linfei1 LI Guizhen2 ZHANG Yuantao1 SHI Yujun1 YANG Pengfei1 LIU Liang1
1.Department of Laboratory， Huai"an City Center for Disease Control and Prevention in Jiangsu Province， Huai"an 223001， China； 2.Laboratory of Molecular Biology， the Fourth People"s Hospital in Huai"an City in Jiangsu Province， Huai"an 223001， China
[Abstract] Objective To investigate the value of T cells spot test （T-SPOT.TB） in tracking treatment of tuberculosis patients and investigation of latent tuberculosis. Methods From December 2012 to August 2014， peripheral blood T-SPOT.TB were measured in the 44 patients with active tuberculosis， 50 patients with extra-pulmonary tuberculosis， 45 patients with latent tuberculosis， 92 patients with close contactors of active tuberculosis， 45 patients with close contactors of extra-pulmonary tuberculosis， 31 medical workers of tuberculosis control and 88 healthy individuals. Results The positive rate of T-SPOT.TB for the diagnosis of active tuberculosis， extra-pulmonary tuberculosis， latent tuberculosis were 52.27%， 52.00%， 55.56%， and healthy individuals was 6.82%， The positive rate of those three kinds of patients was statistically significant with the positive rate of healthy individuals （P<0.01）. The positive rate of close contactors of active tuberculosis， close contactors of extra-pulmonary tuberculosis， medical workers of tuberculosis control were 30.43%， 11.11% and 19.35%. The positive rate of close contactors of active tuberculosis was statistically significant with the positive rate of healthy individuals （P<0.01）， while the positive rate of close contactors of extra-pulmonary tuberculosis and medical workers of tuberculosis control was no statistically significant with the positive rate of healthy individuals（P>0.05）. Conclusion T-SPOT.TB assay can be an effective method for repaid diagnosis of latent tuberculosis infection and the treatment of tuberculosis patients with high specificity and sensitivity， and also is a very useful method for the prevention and control of tuberculosis.
[Key words] Tuberculosis； Latent tuberculosis； T cell spot test； Positive rate
结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据世界卫生组织（WHO）估计，全球约有1/3人口受到结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染。2010年，全球约有880万新发结核病例，145万人死于结核病[1]。2013年全球有900万人罹患结核病，其中近50万人感染的是很难治疗的耐多药结核病；2012～2013年淮安市共发现活动性肺结核患者4907例，新发涂阳1319例，随着耐多药结核病数量的不断上升及人类免疫缺陷病毒并发感染，结核病的防治工作变得更为严峻[2]。当前结核的诊断存在耗时长、灵敏度低等问题，探索快速、简便的诊断方法一直是国内外学者们研究的焦点。
根据结核感染的状态，人群可以分为无结核感染、活动性结核、潜伏性结核和治愈。潜伏性结核（latent tuberculosis infection，LTBI）是宿主感染结核分枝杆菌后尚未发病的一种特殊状态，潜伏性结核不仅威胁个人健康，亦有可能成为潜在的传染源，对家庭和社会造成危害。结核病患者经过治疗后往往缺乏有效的愈后监测，给结核病的防控增加了许多困难。T-SPOT.TB的原理是利用结核特异抗原（ESAT.6.CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断受试者是否感染结核杆菌（现症感染） 的新方法。该试验仅需24 h即可得到检测结果，具有操作简单、周期短、灵敏度和特异性高等优点[3-6]。结核感染T淋巴细胞斑点试验（T-SPOT.TB，Oxford Immunotec）作为结核潜伏感染的诊断手段已经在多项研究中证实具有很高的灵敏度和特异性[7-10]。为了解淮安市登记在册的经治疗的肺外结核及确诊并经治疗的肺结核患者以及结核患者家庭密切接触人群和结核病防治工作者结核病潜在感染情况，本研究对上述人群进行抽样采集血液进行T-SPOT.TB，以了解该群体的结核感染状态，利于结核病控制，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2012年12月～2014年8月淮安市洪泽县黄集镇、朱坝镇登记在册的肺结核病患者及其密切接触的家庭成员，其中治疗后肺结核患者44例，肺外结核患者50例，年龄30～79岁，男45例，女49例；潜伏结核患者（服药3个月后）45例、肺结核患者家庭密切接触者92例、肺外结核患者家庭密切接触者45例，其中男87例，女95例，3～15岁8例，16～30岁13例，30岁以上161例，年龄最小3岁，年龄最大77岁；31例结核病防治工作者，另选择非结核患者家庭密切接触者（正常人群）88例为对照，分别采集静脉血5 mL，进行T-SPOT.TB检测。
1.2 材料
RPMI 1640细胞培养液，细胞培养液AIM-V培养基，Ficoll-Hyperque淋巴细胞分离液，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），T-SPOT.TB试剂盒。
1.3 T-SPOT.TB试验方法
采集肝素抗凝血5 mL，分离PBMC进行计数，保证加入反应孔中的细胞数达到2.5×105个/100 μL；每个检测需4个反应孔，分别为阴性、ESAT-6、CFP-10、阳性孔；加好细胞和刺激源后放入5%CO2，37℃培养18～24 h；洗涤后加入生物素标记的二抗，反应1 h；洗涤后加入显色剂，避光显色7 min后，在细胞因子分泌的地方形成斑点，通过计数斑点检测受结核特异性抗原刺激后释放γ干扰素的效应T淋巴细胞数量。阴性孔内斑点数<6时，ESAT-6或CFP-10孔中斑点数-阴性孔≥6结果为阳性；若阴性孔内斑点数≥6时，ESAT-6或CFP-10孔中斑点数>阴性孔的2倍结果亦为阳性。
1.4 再次T-SPOT.TB检测
对T-SPOT.TB检测结果阳性的密切接触者（潜伏性结核）进行预防性服药治疗，治疗后再次进行T-SPOT.TB检测。
1.5 观察指标
观察结核患者治疗前后T-SPOT.TB检测阳性率和阴性率。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件分析数据，率（%）的比较均采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 结核患者治疗后 T-SPOT.TB检测结果比较
根据T-SPOT.TB试剂盒说明书，检测结果见图1。经检测发现，治疗后肺结核患者、治疗后肺外结核患者和潜伏结核患者（3个月服药后）阳性率分别为52.27%、52.00%和55.56%，而正常人群阳性率为6.82%，χ2检验表明，治疗后肺结核患者、治疗后肺外结核患者和潜伏结核患者阳性率与对照者比较差异均具有高度统计学意义（P<0.01），见表1、图1。
表1 结核患者经治疗后T-SPOT.TB检测结果比较
2.2 结核患者密切接触者T-SPOT.TB检测结果比较
T-SPOT.TB检测结果表明，肺结核患者家庭密切接触者、肺外结核患者家庭密切接触者和结核病防治医务工作者的阳性率分别为30.43%、11.11%和19.35%，χ2检验表明，肺结核患者家庭密切接触者阳性率与正常人群阳性率（6.82%）相比差异具有高度统计学意义（P<0.01），而肺外结核患者家庭密切接触者和结核病防治医务工作者与正常人群比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 结核密切接触者的T-SPOT.TB检测结果比较
3讨论
肺结核患者经治疗后常采用查痰及影像学判断患者是否有治疗效果，肺外结核患者经治疗后一般通过影像学和病理学检查判断患者是否有治疗效果，而没有检查患者体内是否还有结核菌在继续感染增殖。肺外结核病变部位不一致，典型的临床症状不明显，容易被忽视，以致临床上常被误诊或漏诊，需要通过临床症状和辅助检查，特别是病理检查综合分析诊断结核感染。Kim等[11]报道，在肺外结核患者中，T-SPOT.TB的阳性率为94%。还有试验表明，IGRA准确性对于活动性肺内、肺外结核的诊断没有明显差异[12]。T淋巴细胞斑点试验（T-SPOT.TB）作为结核潜伏感染的诊断手段已经在多项研究中证实具有很高的灵敏度和特异性。在结核杆菌特异性抗原刺激下，测定外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中能够释放IFN2γ的T细胞数量，从而判断出体内是否还有结核菌感染。本次实验我们采用T-SPOT.TB技术检测经治疗的肺内、肺外结核患者的血液判断患者经药物治疗的效果，经检测44例肺结核患者，T-SPOT.TB阳性23例，阴性21例，阳性率为52.27%；50例肺外结核患者，26例阳性，24例阴性，阳性率为52.00%，与正常人群比较差异具有统计学意义（χ2=35.35、36.54，P<0.01），表明T-SPOT.TB检测阳性者还需进一步服药治疗。
结核患者的家庭成员及结核病防治工作人员属于密切接触人群，为高风险人群。92例肺结核患者家庭密切接触者阳性28例，阳性率为30.43%，肺外结核患者家庭密切接触者45例，阳性率为11.11%，结核病防治工作者31例，阳性率为19.35%，正常人群阳性率为6.82%，肺结核患者家庭密切接触者阳性率与正常人群阳性率相比差异具有统计学意义（χ2=16.37，P<0.01），而肺外结核患者家庭密切接触者和结核病防治医务工作者与正常人群相比差异无统计学意义（χ2=0.72、3.54，P>0.05）；主要由于肺结核的传染以呼吸道传播为主，传播速度快，范围广，肺外结核因感染的部位不同，以排泄物的接触传播为主，多数的肺外结核（如淋巴结核、骨结核等）因不能将病原菌排出体外，对密切接触者几乎没有传染性。通过检测说明结核患者的家庭中，更应注意结核病的防范，加强防御措施。对于已经感染的群体，应注意身体状况。已有研究表明，很多因素会导致潜伏结核发展为活动结核，包括饮酒、体重过轻、抽烟等不良习惯。接触者与患者的接触时间增加， 结核潜隐感染的危险性增加， 可能与结核感染与接触结核患者产生的时间累积效应有关[13]。医务人员还需不断加强自身的防范意识。
T-SPOT.TB检测结果阳性的密切接触者（潜伏性结核）45例，空腹采血做转氨酶及X光检测，X光检测结果有1例已有轻度结核性胸膜炎表现，转氨酶检测皆正常，对T-SPOT.TB检测结果阳性的密切接触者（潜伏性结核）进行预防性服药治疗，采取知情自愿的原则，预防性服药方案：体重≥50 kg，异福片（内含 0.15 g异烟肼 和0.3 g利福平），1次/1 d，1次2片，服药3个月。体重<50 kg者，异烟肼0.3 g，1次/d，利福平0.3 g，1次/d。预防性服药90 d，并进行跟踪观察。90 d后，采静脉血T-SPOT.TB检测，检测结果见表1。其中25例T-SPOT.TB检测结果仍为阳性，20例阴性，阳性率为55.56%，说明此类患者体内依然存在结核致敏的效应T淋巴细胞。鉴于目前大量研究表明T-SPOT.TB在结核患者中灵敏度为95%左右[14-19]，而此次检测中T-SPOT.TB结果有45%的患者为阴性，说明此类患者体内已经没有了结核致敏的T细胞，治疗效果明显。
T-SPOT.TB检测是利用外周血进行检测，相比传统TST等检测手段，简便易行，且准确度更高。检测物不仅局限于静脉血、支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等，也可用于对肺内及肺外结核的诊断。T-SPOT.TB在结核病的诊断中具有良好的前景和应用价值，尤其是在潜伏性结核感染及菌阴肺结核和肺外结核的诊断与鉴别诊断中。随着方法的改进以及新抗原的应用，T-SPOT.TB很可能会成为新一代的结核病诊断方法。本文对已治疗肺结核患者、已治疗肺外结核患者和潜伏结核患者（已治疗）采用T-SPOT.TB检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断受试者是否还存在结核杆菌感染，对结核患者的治疗效果作出评价，为结核病的防控提供一个非常好的监测手段，值得在今后的工作中进一步加以推广。
[参考文献]
[1] Murray CJ，Ortblad KF，Guinovart C，et al. Global，regional，and national incidence and mortality for HIV，tuberculosis，and malaria during 1990-2013：A systematic analysis for the global burden of disease study 2013[J]. Lancet，2014，384（9947）：1005-1070.
[2] Wood R，Middlekoop Middlekoop K，Myer L，et al. Undiagnosed tuberculosis in a community with high HIV prevalence：Implications for tuber.Culosis control[J]. Am J Respir Crit Care Med，2007，175（1）：87-93.
[3] Feng Y，Diao N，Shao L，et al. Interferon-gamma release assay performance in pulmonary and extrapulmonary tuberculosis[J]. P LoS One，2012，7（3）：e32652.
[4] 卢峰岳，黄艳君，刘春平，等. γ-干扰素释放试验诊断活动性结核病的临床评价[J]. 实用医学杂志，2013，29（23）：3827-3829.
[5] 孔令和，柯云霞，高素香，等. IFN-γ释放试验（T-SPOT.TB）在结核病诊断中的应用[J]. 实验与检验医学，2013， 31（6）：535-537.
[6] 王凤平，陈蕾，陈苏芳，等. 结核感染T 细胞检测在肺外结核诊断应用价值[J]. 实用预防医学，2014，21（10）：1247-1249.
[7] 卢青纯，唐小燕，熊恬园，等. T-SPOT.TB试验在活动性结核诊断中的价值及其影响因素分析[J]. 中国循证医学杂志，2014，14（5）： 522-526.
[8] 王立红，付秀华，张桂芝，等. 结核感染T 细胞斑点试验在结核病诊断中的应用价值[J]. 中国防痨杂志，2013 ，35（12）：992-996.
[9] 张健东，许辛，丁贤，等. 以多表位融合抗原检测结核分枝杆菌抗体、TB-SA抗体检测和噬菌体裂解法快速检测在结核病诊断中应用价值研究[J]. 中国卫生检验杂志，2012，22（3）：538-539.
[10] 于永敏，任鹏飞，陈裕. T-SPOT.TB诊断活动性结核病的应用价值[J]. 医药论坛，2014，35（7）：106-107.
[11] Kim SH，Choi SJ，Kim HB，et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis[J].Arch Intern Med，2007，167（20）：2255.
[12] 王永生，宁靓，蒋芳萍，等. 结核感染T 细胞斑点试验在结核性腹膜炎诊断中的临床研究[J]. 四川医学，2014， 35 （3）：296-297.
[13] 杨华，张丽婷，李连青，等. 结核分枝杆菌H37Rv结合肽的筛选研究[J]. 中华结核和呼吸杂志，2011，34（3）：192-196.
[14] 路丽苹，洪建军，金晓萍，等. 以T- SPOT.TB 检测为依据的结核病人密接者感染状况及影响因素研究[J]. 现代预防医学，2013，40（3）：568-570.
[15] Nishimura T，Hasegawa N，Mori M，et al. Accuracy of an interferon-gamma release as-say to detect active pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis[J]. International Journal of Tuberculosis and Lung Diseases，2008，12（3）：269.
[16] 刘国威，梅早仙. 干扰素释放分析T-SPOT.TB在结核性胸腔积液中的诊断意义[J]. 临床肺科杂志，2012，18（10）：1850.
[17] 刘国威，梅早仙. 干扰素释放试验在肺外结核病诊断中的临床意义[J]. 吉林医学，2012，33（10）：2056-2058.
[18] 汪敏，张琦，张清林. 结核感染T细胞斑点试验对结核性胸膜炎的诊断价值[J]. 当代医学，2015，21（15）：35-36.
[19] 刘艳. T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值[J]. 当代医学，2013，19（8）：12-14.
（收稿日期：2015-07-08）