超声一微波辅助提取枳棋多糖的研究

摘要：采用超声-微波联合提取技术从枳椇中提取多糖，通过单因素试验和正交L9（34）试验研究了超声功率、微波功率、提取时间、液料比等条件对枳椇多糖提取的影响。试验结果表明：以蒸馏水为提取溶剂，枳椇多糖最佳提取条件为超声功率500 W、微波功率300 W、提取时间15 min、料液比1 g ∶15 mL，在此条件下枳椇多糖得率为67%；各因素影响强弱依次为超声功率、微波功率、提取时间、液料比。超声-微波辅助提取法较传统的回流提取法具有耗时短、提取率高等优点，此法亦具有良好的稳定性和重现性。

关键词：枳椇；多糖；超声波；微波；提取工艺

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0263-03

收稿日期：2014-04-20

基金项目：四川理工学院大学生创新基金（编号：cx20120407）。

作者简介：魏丕伟（1983—），男，博士，讲师，主要从事生物技术方面的研究。Tel：（0813）5505979；E-mail：weipiwei2004@163.com。

通信作者：王凌云。E-mail：wanglingyun2004@163.com 。枳椇（Hovenia acerba Lindl.）为鼠李科枳椇属植物，属落叶乔木，俗名拐枣、万寿果、鸡脚爪等，我国除东北、新疆、西藏以外大部分省份均有零星分布[1-2]。其药用部分为带有肉质果柄的果实和种子，该物有清热利尿解酒毒之功效， 主治酒毒、烦热、口渴、呕吐、二便不利等症[3]。参阅相关文献可知，近年来国内外对枳椇属植物活性成分的研究主要集中在生物碱、黄酮类的提取工艺和药理方面，对多糖的研究少有见刊[4-5]。本试验采用超声微波联合提取技术，利用超声的空化效应以及微波的高能作用[6]，提高枳椇多糖的提取效率，缩短工艺时间，为进一步对多糖的研究提供有利条件。

1材料与方法

1.1试验材料

枳椇购于安国药材市场，产地湖北。摘取枳椇果柄，用自来水清洗，置于烘箱55 ℃烘干，粉碎，过60目筛，粉末备用。

1.2试剂

蒽酮，分析纯，上海科丰化学试剂有限公司；无水乙醇，分析纯，重庆川东化工有限公司；浓硫酸，分析纯，重庆川东化工有限公司；茚三酮，分析纯，成都奥克生物有限公司；葡萄糖、石油醚、氯仿、正丁醇等均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

1.3主要仪器设备

SL-SM200超声微波组合反应系统，南京顺流仪器有限公司；Alpha1-2 LD plus冷冻干燥机，德国CHRIST；756型紫外可见分光光度计，上海奥普勒仪器有限公司；TP114电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器设备公司；RT-34静音研磨粉碎机，弘荃机械企业有限公司；等。

1.4试验方法

1.4.1试验样品的前处理对枳椇粉末进行脱脂、除单糖处理[7]。

1.4.2多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸比色法。蒽酮-硫酸试剂的配制及标准曲线的绘制参照文献[8]。

1.4.3枳椇多糖的提取与精制称取经过前处理的枳椇果柄粉末，加入相应比例蒸馏水，在超声-微波组合反应系统中设置参数进行提取，滤液过滤后在旋转蒸发仪中70 ℃浓缩至1/3；浓缩液加入4倍体积的95%乙醇，沉淀24 h，离心，弃去上清液，沉淀冷冻干燥，得褐色枳椇粗多糖。将粗多糖用蒸馏水溶解，加入1/4体积Sevag混合液（体积比为5 ∶1的氯仿-正丁醇），磁力搅拌1 h，离心，取上层液重复处理多次直至01%茚三酮乙醇溶液检测无紫红色出现。称取一定量活性炭，80 ℃加热搅拌15 min，脱色后，离心10 min，弃去沉淀，重复操作至上清液明显变清。取溶液，透析袋透析除去离子，最后将溶液冷冻干燥得浅褐色枳椇精制多糖。

1.4.4多糖含量测定及得率计算枳椇多糖的换算因子f=2.174[9]，纯度=1/f=1/2.174=46.00%。

多糖含量（mg/g）=多糖稀释液中葡萄糖浓度（mg/mL）×多糖的稀释因素试验样品质量（g）

多糖得率=精制枳椇多糖粉末中多糖的质量（g）枳椇果柄中多糖的质量（g）×100%

多糖产率=精制枳椇多糖粉末中多糖的质量（g）枳椇果柄的质量（g）×100%

1.4.5提取条件的选择以蒸馏水作为提取溶剂，选取超声功率、提取时间、微波功率、液料比、提取次数5个因素进行单因素试验，所得提取液过滤后定容至250 mL，再从中移取 5 mL 加入50 mL容量瓶中，使其稀释10倍，取2 mL稀释液进行硫酸-蒽酮反应后测其吸光度，根据吸光度大小确定每一因素的最佳值。根据单因素试验结果，从中选择影响较大的4个因素，每个因素分设3个梯度水平，采用L9（34）正交表作正交设计试验，水提后按上述方法测定其吸光度，计算多糖含量，确定枳椇多糖提取的最佳条件。

1.5试验方法评价

通过稳定性试验、精密度试验和重现性试验的结果及相对标准偏差，评价本试验中采用超声微波组合反应系统设备及蒽酮-硫酸比色法是否具有良好的稳定性、重现性及精密度是否能满足试验需求。

2结果与分析

2.1标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度（D）为纵坐标，测定结果用最小二乘法作线性回归，得线性回归方程为：y=27.064x+0.008 5，r2=0.999（图1）。

2.2单因素试验结果分析

2.2.1超声功率对提取效果的影响准确称取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”节方法处理后，分别置于150 mL试验瓶中，加入150 mL蒸馏水。在超声微波组合反应系统中设定试验参数，提取时间为5 min，微波功率为400 W，超声功率梯度为0、200、400、600、800 W，提取1次。由图2可知，吸光度随超声功率在0～600 W范围内增大而增大，超过600 W后降低。由此分析，适宜强度超声的空化作用破坏胞壁有利于多糖的溶出从而提高提取效率，而超声功率过高空化作用增强使其化学效应增加对多糖结构造成破坏，使得吸光度降低。综合考虑，为避免超声空化作用对多糖活性的影响，故最佳超声功率应稍低于最高值，选取500 W为宜。

2.2.2提取时间对提取效果的影响准确称取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”节的方法处理后，分别置于150 mL试验瓶中，加入150 mL蒸馏水。在超声微波组合反应系统中设定试验参数，超声功率为500 W，微波功率为400 W，提取时间梯度为5、10、15、20、25 min。由图3可知，随着提取时间的延长，吸光度随之增大，在15 min时达到拐点，数据曲线变得较为平缓。由分析可见超声微波联合提取法相对于回流提取法在提取时间上有显著优势。提取时间过长对枳椇粉末有较为显著的破碎效果而不利于过滤，而且过长的提取时间浪费能量，综合考虑，提取时间选15 min较佳。

2.2.3微波功率对提取效率的影响准确称取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”节的方法处理后，分别置于150 mL试验瓶中，加入150 mL蒸馏水。在超声微波联合辅助提取仪中设定试验参数，超声功率为500 W，提取时间为15min，微波功率梯度为0、200、400、600、800 W。由图4可知，微波功率达到400 W时，吸光度达到最大，其后随微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知适宜强度微波功率有利于多糖的溶出，而微波过强反而会降低提取效率。

2.2.4料液比对提取效率的影响准确称取质量为5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”节的方法处理后，分别置于相应试验瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸馏水。在超声微波联合辅助提取仪中设定试验参数，超声功率为500 W，提取时间为15 min，微波功率为400 W。由图5可知，随着料液比增大，吸光度增长，但当料液比达到1 g ∶20 mL时，曲线变得较平缓，综合考虑，选取1 g ∶20 mL为最佳料液比。

2.2.5提取次数对提取效率的影响准确称取质量为 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”节的方法处理后，分别置于2号试验瓶中，加入150 mL蒸馏水。在超声微波联合辅助提取仪中设定试验参数，超声功率为500 W，提取时间为 15 min，微波功率为400 W，料液比为1 g ∶20 mL，依次增加提取次数。由图6可知，随着提取次数的增加，吸光度也在缓慢上升，其上升幅度较小，重复提取5次较提取1次吸光度上升幅度小于15%，说明采用超声微波辅助提取，初次提取率较高，多糖溶出较为充分，再增加提取次数，多糖浸出率的增加不明显，为节约时间和简化正交试验步骤，采用1次提取即可。

2.3正交试验结果

提取工艺受多个因素影响，且各因素间有交互作用；通过单因素试验确定各因素的影响程度与作用效果，为进一步正交试验提供依据。本次正交试验选取了超声功率、提取时间、微波功率、料液比4个因素进行试验，每一个因素选取3个水平，通过正交试验结果选择最佳提取条件。（min）D：微波功率

变异来源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05误差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00。

通过直观分析，从极差R可判断4个因素对枳椇多糖提取影响的大小顺序为：提取时间>微波功率>料液比>超声功率（表2）。将极差最小的超声功率这一项作为误差列进行方差分析，表明提取时间、微波功率这2项具有显著性差异，说明在提取过程中提取时间和微波功率所设计的不同水平对提取效率有显著影响。其他因素水平间差异不显著（表3）。

从正交试验结果可知多糖含量最高的提取组合是A3B1C2D3，由于超声功率和料液比水平间差异不显著，且提取时间3水平中 Δk2-1明显大于Δk3-2，说明随着时间延长提取时间对提取效果影响减小，故在降低能耗条件下可选取A1B1C2D3（超声功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取时间 15 min，微波功率400 W）作为最佳提取条件。在本次试验中，超声功率这一因素在正交试验中极差较小，但在单因素试验中采用超声与不用超声对吸光度有较大影响，说明低功率超声的空化作用和机械效应有一定的辅助提取作用。

2.4试验方法评价

2.4.1精密度按单因素测定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取条件（超声功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取时间15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同条件下从中取5份样品液进行蒽酮-硫酸比色检测，测得吸光度分别为0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，计算得相对偏差（RSD）为0.375 8%，表明该方法具有较高的精密度，能满足样品分析要求。

2.4.2重现性按单因素测定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3条件下得到5份提取液，对5份样品液进行蒽酮-硫酸比色检测，测得其吸光度分别为0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相对偏差（RSD）为1294%，表明采用超声-微波组合反应设备进行提取的重现性良好，说明该设备功率稳定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重现性。

2.4.3稳定性按单因素测定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3条件下得到提取液，在常温下放置0、30、60、90、120、150、180 min，测定吸光度分别为0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發现随时间延长吸光度有下降趋势，但幅度不大，其相对偏差（RSD）为0.270%，表明在 180 min 内样品具有良好的稳定性。

3结论与讨论

本试验通过正交试验得到采用超声-微波辅助提取设备提取枳椇多糖的最佳工艺为A1B1C2D3（超声功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取时间15 min，微波功率400 W）。在确定最佳工艺条件下枳椇多糖含量为12.715 mg/g，实际提取得到多糖8.505 mg/g，其得率为67%；对比采用回流水提法提取枳椇多糖的文献，其最佳工艺为：温度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取时间2 h，提取次数3次，枳椇多糖含量为 10.288 mg/g，得率62.818%[9]。可见，采用微波辅助提取设备提取时间短，初次提取率高，多糖产量和得率较回流提取法高，说明采用超声微波辅助提取法在提取时间和提取效率上有较大优越性。

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