藏药小檗皮的质量标准研究

材料

美国Agilent 1200高效液相色谱仪，配备二极管阵列（DAD）检测器、自动进样器和柱温箱；Sartorius BP121s电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；2.5-12型箱式电阻炉（沈阳市节能电炉厂）；ULUP-I-10T优普超纯水机（成都超纯科技有限公司）；CQ-250超声波清洗器（上海必能信有限公司）。盐酸小檗碱（批号0713-9605）、盐酸巴马汀（批号11073-201108）、盐酸药根碱（批号110733-201108）对照品及小檗皮对照药材（批号 1001-200202）均购自中国食品药品检定研究院，木兰花碱（批号MUST-14122416）对照品购于成都曼思特生物科技有限公司，HPLC检测纯度大于98%，可供含量测定使用。乙腈为色谱纯（Fisher），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。本研究共收集了18批小檗皮药材，主要来自于西藏、青海、四川等地的藏医院及药材市场，见表1。

2 方法与结果

2.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定

水分测定参照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H 第一法；总灰分、酸不溶性灰分测定参照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K灰分测定法。18批样品的水分、灰分、酸不溶性灰分的测定，见表1。

2.2 浸出物的测定

取各批次小檗皮药材粉末约2 g（过3 号筛），精密称定，以50%乙醇作为提取溶剂，按照《中国药典》2010年版一部浸出物（附录Ⅹ A）项下的热浸法测定，结果见表1。

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 对照品溶液的制备 取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 各含0.35 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液和对照药材溶液制备 取0.5 g药材粉末（过3号筛），加甲醇5 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取小檗皮对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。

2.3.3 薄层色谱条件及样品检识 照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各2 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（6∶3∶3∶2∶1）为展开剂，置用氨蒸气预饱和15 min的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。按上述条件对18批小檗皮药材进行薄层色谱鉴别，结果所有样品中4种特征成分的分离度较好，斑点清晰，并且18批药材具有较好的一致性，见图1。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱InertSustain C¹⁸色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min^-1；进样量10 μL；检测波长270 nm；流动相乙腈-0.2%磷酸溶液。理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于5 000。对照品溶液和供试品溶液的HPLC 色谱图见图2。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取木兰花碱78.0 mg、盐酸药根碱13.8 mg、盐酸巴马汀7.2 mg、盐酸小檗碱21.6 mg，加甲醇溶液分别定容于10 mL量瓶中，得对照品贮备液；分别依次吸取上述对照品贮备液 10，5，5，10 mL 混合于 50 mL量瓶中，得混合对照品贮备溶液（木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的质量浓度依次为1.56，0.138，0.072，0.432 g·L^-1）。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-70%甲醇（1∶100）50 mL，称定质量，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用盐酸-70%甲醇（1∶100）补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系的考察 分别精密吸取上述混合对照品贮备溶液0.5，1，2，4，5，6，8 mL至不同的10 mL量瓶中，分别加入甲醇稀释至刻度，即得系列浓度混合对照品溶液。取各系列浓度混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，测定其峰面积，以各对照品峰面积值为纵坐标，质量浓度（g·L^-1）为横坐标，进行线性回归，得木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的回归方程分别为Y=14 632X+45.114，r=0.999 7；Y=35 640X+26.526，r=0.999 7；Y=38 575X+0.893 4，r=1.000 0；Y=34 466X+26.506，r=0.999 9，四者分别在0.078 0～1.248 0，0.006 9～0.110 4，0.003 6～0.057 6，0.021 6～0.345 6 g·L^-1成良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液（XBP140822）10 μL，于同1日内分别连续进样6次，记录色谱峰峰面积。结果木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积值的RSD分别为0.29%，0.55%，0.15%，0.14%，表明日内精密度良好。取以上供试品溶液连续测定3 d，每天进样2次，记录色谱峰峰面积。结果4个成分峰面积的RSD分别为0.69%，0.19%，0.39%，0.42%，表明其日间精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取本品粉末（XBP140822）约0.5 g，精密称定，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取该供试品溶液10 μL，于0，1，2，4，8，12，24 h分别注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积，计算含量。结果木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量的RSD分别为0.65%，1.1%，1.7%，0.71%。RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.7 重复性试验 取本品粉末（XBP140822）约0.5 g，共6份，精密称定，分别按2.4.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算含量，结果木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量的RSD分别为0.73%，1.6%，1.5%，0.55%。RSD均小于3%，表明方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取同一批已知含量的样品粉末（XBP140822）9份，每份约0.25 g，精密称定，分别按已知含量的80%，100%，120% 3个水平加入木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，依次测定，计算回收率。结果木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为99.98%，98.47%，101.9%，100.6%，RSD分别为0.91%，2.7%，0.95%，1.5%。

2.4.9 样品含量测定 精密称取不同批次的小檗皮药材粉末，平行3份，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，并以干燥品计算木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量，见表1。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别

本研究参照黄连、黑果小檗及小檗皮复方制剂的薄层鉴别展开系统^[10-13]，考察了正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）、环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（6∶3∶3∶2∶1）（置氨蒸气中预饱和15 min）、乙酸乙酯-甲醇-浓氨水（7∶5∶0.5）4个展开系统，并考察了供试品溶液的不同点样量（1，2，3，5 μL）。结果以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水（6∶3∶3∶2∶1）（置氨蒸气中预饱和15 min）为展开剂效果最佳，小檗皮中4种成分均能得到很好的分离，点样量为2 μL时，斑点清晰。另外，还考察了不同薄层板、温度、湿度等条件对薄层展开的影响，结果不同的薄层板、温度和湿度对展开结果没有太大影响，说明建立的薄层鉴别方法耐用性较好。

3.2 浸出物的测定

藏药小檗皮与中药黄连、三棵针的化学成分相似，均含有小檗碱、巴马汀、木兰花碱等生物碱类成分，因此本研究参照《中国药典》2010年版一部中黄连、三棵针的浸出物测定方法^[14]，以乙醇为提取溶剂，并考察了冷浸法与热浸法对提取效率的影响，结果热浸法测得的浸出物含量较高。此外，分别考察了4种提取溶剂（30%，50%，70%， 95%乙醇）对浸出物提取的影响，结果以50%乙醇所得的浸出物含量最高，因此选择50%乙醇作为小檗皮浸出物测定的提取溶剂。

3.3 含量测定

现代研究表明，小檗属植物中主要含有小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱、小檗胺等生物碱类成分^[15-16]。通过对照品对照，发现小檗皮药材中小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱的含量较高，但小檗胺的含量甚微。药理学研究表明，小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱具有明显的抗炎、抗菌等生物活性，这与藏医用小檗皮治疗痢疾、尿路感染、肾炎等疾病相吻合。目前，关于藏药小檗皮有效成分的定量分析研究较少，仅几篇文献[8-9]报道了药材中小檗碱的含量测定，但仅以小檗碱为单一指标进行质量控制专属性较差。为了提高藏药小檗皮的质量控制水平，本研究以小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱同时作为指标建立药材的质量标准。含量测定结果表明，以干燥品计算，小檗皮药材中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均分别为6.0%，0.63%，0.30%，2.5%，其中以木兰花碱的含量最高，小檗碱含量次之。

3.4 限量标准制定建议

本研究收集的18批样品均来自于四川、西藏、青海等藏区的藏医院、藏药企业及药材市场，样品具有代表性，研究结果能充分反映小檗皮药材的实际情况。根据测定结果，按照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求，并参考《中国药典》中黄柏、厚朴等皮类药材标准，建议规定小檗皮药材的水分不得过13.0%，总灰分不得过7.0%，酸不溶性灰分含量较低（均小于1.0%），故不予限定；照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用50%乙醇作溶剂，不得少于25.0%。另外，为了避免对每一个成分制定含量下限可能出现质量评价结果相悖的情况，特参照《中国药典》中人参、三七、大黄等药材标准，以多种有效成分之和制定含量限度，即按干燥品计算，本品含木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱的总量不得少于7.0%。

[参考文献]

[1]帝玛尔·丹增彭措. 晶珠本草[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1986： 175.

[2]青海省药品检验所， 青海省藏医药研究所. 中国藏药.第3卷[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1996： 28.

[3]罗达尚. 中华藏本草[M]. 北京： 民族出版社， 1997： 84.

[4]岳丽珺， 孟宪丽， 张燕， 等. 藏药小檗皮对糖尿病大鼠视网膜PKC-βVEGF、HIF-1α表达的影响[J]. 世界科学技术——中医药现代化， 2014， 16（1）： 181.

[5]张燕， 孟宪丽， 岳丽珺， 等. 藏药小檗皮对糖尿病模型小鼠血糖水平影响的初步研究[J]. 现代生物医学进展， 2013， 13（19）： 3619.

[6]中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准.藏药.第1册[S]. 1995： 340.

[7]西藏、青海、四川、甘肃、云南、新疆卫生局. 藏药标准[S]. 西宁： 青海人民出版社，1979： 11.

[8]子巴. HPLC法测定不同产地藏药小檗皮中盐酸小檗碱含量比较[J]. 四川中医， 2011， 29（9）： 45.

[9]张琦， 田淑琴， 郑丽琴， 等. 藏药小檗皮中小檗碱的含量测定[J]. 中国民族医药杂志， 2000， 6（3）： 41.

[10]李铁钢， 李钰婷， 武小赟， 等. 黄连及其炮制品薄层鉴别方法的研究[J]. 时珍国医国药， 2011， 22（3）： 677.

[11]孙颖平， 李莉. 新疆特色药材黑果小檗薄层鉴别方法研究[J]. 西北药学杂志， 2013， 28（3）： 231.

[12]张玉良， 李一年， 黄慧. 晶珠糖尿康胶囊的质量标准研究[J]. 中国中医药信息杂志， 2002， 9（8）： 33.

[13]刘合禄， 庄肃农， 齐静. 十八味诃子利尿丸质量标准研究[J]. 齐鲁药事， 2010， 29（4）： 213.

[14]中国药典.一部 [S]. 2010.

[15]吕光华， 王立为， 陈建民， 等. 小檗属植物中的生物碱成分测定及资源利用[J]. 中草药， 1999， 30（6）： 1.

[16]郑晓峰， 王勤. 不同部位不同采收季节甘肃小檗属植物中生物碱类含量的比较[J]. 兰州大学学报：医学版， 2009， 35（1）：71.

[责任编辑 丁广治]

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