1338例孕前育龄妇女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突变结果分析

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[摘要] 目的 探讨孕前育龄妇女亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T、A1298C基因和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G基因检测在出生缺陷防控技术应用中的价值。 方法 选择2015年1月～2016年12月在我院做孕前检查的1338例育龄妇女为研究对象，抽取靜脉血，提取全血中的DNA，使用荧光定量PCR法进行检测MTHFR C677T、A1298C基因突变位点和MTRR  A66G基因突变位点，分析基因频率分布情况。 结果 1338例孕前育龄妇女的MTHFR C677T位点CC、CT、TT基因型频率分布分别为58.6%、35.0%、6.4%;MTHFR基因A1298C位点AA、AC、CC基因型频率分布分别为62.5%、30.0%、7.5%; MTRR基因A66G位点AA、AG、GG基因型频率分布分别为53.1%、39.8%、7.1%。MTHFR C677T位点基因型频率分布与佛山、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较，有显著差异（χ2=189.81、663.24、791.40、99.09、712.34，P<0.05）;MTHFR A1298C位点基因型频率分布与佛山、珠海、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较有显著差异（χ2=45.33、20.21、60.92、103.24、22.83、84.56，P<0.05）;MTRR A66G位点基因型频率分布与郑州、长春研究结果比较有显著差异（χ2=7.290、6.432，P<0.05），而与佛山、珠海、九江、江苏研究结果比较无显著差异（χ2=3.500、0.534、0.537/3.351，P>0.05）。 结论 南宁市孕前育龄妇女MTHFRC677T TT、A1298C CC、MTRRA66G GG基因型频率分布大致一致，但与国内其他地区比较MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点基因型频率分布有地域性差异。因此，孕前育龄妇女补充叶酸或叶酸缺乏者同时检测MTHFR C677T位点、A1298C位点及MTRR A66G位点突变，能全面发现与叶酸代谢能力障碍的相关遗传风险，可为指导孕前育龄妇女预防和干预婴儿出生缺陷提供可靠依据，在出生缺陷防控技术应用中有重要的价值。

[关键词] 孕前妇女;亚甲基四氢叶酸还原酶;甲硫氨酸合成酶还原酶;基因突变;出生缺陷

[中图分类号] R446.9          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）13-0111-04

[Abstract] Objective To investigate the value of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）C677T， A1298C gene and methionine synthase reductase（MTRR）A66G gene detection in the application of birth defects prevention and control technology in pre-pregnancy women of childbearing age. Methods 1338 women of childbearing age who underwent pre-pregnancy examinations in our hospital from January 2015 to December 2016 were selected as study objects. Their venous blood was extracted， and the DNA from whole blood was extracted. MTHFR C677T， A1298C gene mutation site and the MTRR A66G gene mutation site was detected by real-time PCR. And the gene frequency distributions were analyzed. Results The frequency distributions of CC， CT and TT genotypes of MTHFR C677T loci in 1338 pre-pregnancy women of childbearing age were 58.6%， 35.0% and 6.4%， respectively. The frequencies of AA， AC and CC genotypes of MTHFR gene A1298C were 62.5%， 30.0%， 7.5%. The frequency distributions of AA， AG， and GG genotypes of ARR sites in the MTRR gene were 53.1%， 39.8%， and 7.1%， respectively. The frequency distributions of MTHFR C677T locus genotype in Nanning were significantly different from those in Foshan， Zhengzhou， Changchun， Jiujiang and Jiangsu（χ2=189.81， 663.24， 791.40， 99.09， 712.34， P<0.05）. MTHFR A1298C locus genotype frequency distributions in Nanning were significantly different from those in Foshan， Zhuhai， Zhengzhou， Changchun， Jiujiang and Jiangsu（χ2=45.33， 20.21， 60.92， 103.24， 22.83， 84.56， P<0.05）. There was a significant difference in MTRR A66G locus genotype frequency distributions between Nanjing and Zhengzhou， Changchun（χ2=7.290， 6.432， P<0.05）， but there was no significant difference between Nanjing and Foshan， Zhuhai， Jiujiang and Jiangsu（χ2=3.500， 0.534， 0.537/3.351， P>0.05）. Conclusion The frequency distributions of MTHFRC677T TT， A1298C CC and MTRRA66G GG genotypes in pre-pregnancy women of childbearing age in Nanning are roughly the same， but there are regional differences in the frequency distributions of MTHFR C677T， A1298C and MTRR A66G loci in Nanning compared with other regions in China. Therefore， the detection of MTHFR C677T locus， A1298C locus and MTRR A66G locus mutation in pre-pregnancy women of childbearing age supplemented with folic acid or folate deficiency can fully discover the genetic risk associated with folate metabolism dysfunction， and can provide a reliable basis for guiding prevention and intervention of infant birth defects in pre-pregnancy women of childbearing age. It has important value in the application of birth defect prevention and control technology.

[Key words] Pre-pregnancy women;Methylenetetrahydrofolate reductase;Methionine synthase reductase;Gene mutation;Birth defect

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）是叶酸-甲硫氨酸-同型半胱氨酸代谢循环过程中的关键酶，其酶活性水平与人体内叶酸浓度、血浆同型半胱氨酸浓度密切相关[1]，MTHFR与MTRR基因突变引起叶酸缺乏和同型半胱氨酸升高，高同型半胱氨酸会损伤血管内皮细胞，引起血小板激活聚集，破坏机体的凝血和纤溶系统[2]，出现血栓形成的倾向而导致流产，而且同型半胱氨酸在器官形成早期对胚胎神经系统具有毒性，因此与神经管缺陷相关。有文献报道MTHFR基因突变率在怀有唐氏综合征患儿的母亲明显升高，特别是MTHFR A1298C的CC基因型[3]与MTHFR C677T的TT基因型[4]是出生缺陷的遗传高风险因素。MTRR基因突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一，MTRR A66G基因型女性携带者未服用叶酸增补剂和低叶酸饮食的情况下均会增加胎儿唇腭裂的风险，若以上两种情况同时存在，则风险进一步增高[5]。因此，目前MTRR、MTHFR基因突变被认为是多种出生缺陷疾病的遗传高风险因素，可作为孕前育龄妇女叶酸代谢能力障碍筛查基因，但基因位点突变频率分布有地域性差别[6]。本研究采用荧光PCR法检测1338例南宁市孕前育龄妇女叶酸代谢关键酶MTHFR C677T、A1298C、MTRR A66G基因突变，旨在了解南宁市孕前育龄妇女MTHFR C677T、A1298C、MTRR A66G基因突变频率分布情况，为指导孕前育龄妇女预防和干预婴儿出生缺陷提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取于2015年1月～2016年12月期间到南宁市妇幼保健院产科门诊进行孕前检查的1338例育龄妇女，年龄22～32岁，平均（27.1±4.9）岁，经知情同意后，抽取静脉血，提取全血中的DNA，采用荧光定量PCR法进行MTHFR C677T、A1298C基因突变及MTRR  A66G基因突变检测，结果与国内其他地区研究结果比较，分析基因突变频率分布和地域性差异情况。

1.2材料与仪器

仪器试剂：①全自动核酸提取仪型号为厦门致善Lab-Aid820，配套提取试剂;②美国伯乐CFX96型荧光定量PCR扩增仪，试剂来源于深圳奥萨制药有限公司。③引物：MTHFR 677T ：5"-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA-3"，MTHFR A1298C： 5"-AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T]CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA-3"，MTRR A66G： 5"-AGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT[A/G]TGTGAGCAAGCTGTGG-TACATGGAT-3"。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取方法  采集受檢者静脉全血，利用全自动核酸提取仪提取全血中的DNA，提取的DNA浓度达到 20 ng/μL，纯度比值达1.8以上既可进行扩增，使用荧光定量PCR扩增方法进行检测。

1.3.2 荧光定量PCR技术  分别检测分析叶酸代谢相关MTHFR C677T、A1298C，MTRR A66G基因突变位点。每个反应体系20 μL：10 μL PCR混合液，0.25 μL探针，5.75 μL双蒸水，4 μL样本提取的DNA。扩增程序如下：50°C预变性2 min，95°C预变性2 min，1个循环;95°C变性15 s，60°C延伸1 min，45个循环。扩增完成后，通过软件合成扩增仪VIC和FAM两个通道所形成的S型扩增曲线进行判断基因突变类型。

1.4 基因型频率分布分析

将南宁市孕前育龄妇女MTHFR C677T、A1298C、MTRR A66G基因突变频率分结果与国内佛山[7]、珠海[8]、郑州[9]、长春[10]、九江[7]、江苏[11]研究报道MTHFR C677T、A1298C位点突变及MTRR A66G突变频率分布比较，分析个体基因突变频率分布和地域性差异情况。

1.5 统计学方法

采用拟和优度χ2检验检测各个位点的基因型分布是否符合哈-温平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），P>0.05表明各基因型的分布符合HWE平衡;采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，组间比较采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哈-温（HWE）平衡检测结果

本研究中，经过HWE平衡定律检验，MTHFRC677T和MTRRA66G位点实际值与预计值吻合（P>0.05），说明群体遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体，具有本区域群体代表性。见表1。

2.2 MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位点基因型频率分布与其他地区结果的比较

1338例孕前育龄妇女的MTHFR C677T位点CC（野生型）、CT（杂合子）、TT（纯合子）基因型频率分布分别为58.6%、35.0%、6.4%;MTHFR基因A1298C位点AA（野生型）、AC（杂合子）、CC（纯合子）基因型频率分布分别为62.5%、30.0%、7.5%; MTRR基因A66G位点AA（野生型）、AG（杂合子）、GG（纯合子）基因型频率分布分别为53.1%、39.8%、7.1%，显示个体基因突变频率分布结果大致一致。MTHFR C677T位点基因型频率分布与佛山、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较，有显著差异（χ2=189.81、663.24、791.40、 99.09、712.34，P<0.05）;MTHFR A1298C位点基因型频率分布与佛山、珠海、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较有显著差异（χ2=45.33、20.21、60.92、103.24、22.83、84.56，P<0.05）;MTRR A66G位点基因型频率分布与郑州、长春研究结果比较有显著差异（χ2=7.290、6.432， P<0.05），而与佛山、珠海、九江、江苏研究结果比较无显著差异（χ2=3.500、0.534、0.537、3.351，P>0.05），显示MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位点基因型频率分布有地域性差别。见表2、表3。

3 讨论

3.1 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因突变（杂合子、纯合子）与叶酸代谢障碍相关系分析

1338例孕前妇女的MTHFR基因C677T位点、A1298C位点及MTRR基因A66G位点突变频率分布结果显示，MTHFR C677T TT、A1298C CC和MTRR A66G GG个体基因突变频率分布均无明显差异，说明本市孕前育龄妇女的MTHFR C677T TT、A1298C CC和MTRR A66G GG基因突变频率大致一致。MTHFR和MTRR是叶酸代谢循环过程中的关键酶[12]，其酶活性水平与人体内叶酸浓度密切相关，有文献报道携带MTHFR 1298C（AC或CC）基因者的酶活性只有野生型（AA）的78%[5]，携带MTHFR C677T CT基因型的酶活性只有野生型（CC）的65%，而基因型TT个体酶活性仅有30%[13]，携带MTRR A66G GG基因者的酶活性只有正常的30%，携带MTRR A66G AG基因者的酶活性只有正常的65%[11]。依据文献报道提示本市部分孕前育龄妇女体内存在叶酸代谢障碍和叶酸不足的风险，叶酸缺乏会导致胚胎发育期的DNA和蛋白甲基化不足导致胎儿发育畸形、流产[13-16]。因此孕前育龄妇女检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因位点突变，可筛查出叶酸代谢能力障碍相关遗传基因[6]，为定期检测叶酸含量及合理补充叶酸提供依据，达到预防胎儿神经管缺陷等出生缺陷相关疾病的发生[17]。

3.2 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因突检测的临床意义

研究结果显示南宁市育龄妇女MTHFR C677T位点基因型频率分布与佛山、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较有显著差异;MTHFR A1298C位点基因型频率分布与佛山、珠海、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较有显著差异;MTRR A66G位点基因型频率分布与郑州、长春研究结果比较有显著差异，而与佛山、珠海、九江、江苏研究结果比较无显著差异。说明MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因型频率分布有地域性差别，与国内学者报道基本一致[7-11]。因此，孕前补充叶酸或叶酸缺乏者，同时检测MTHFR C677T位点、A1298C位点及MTRR A66G位点突变，不但能全面发现与叶酸代谢能力障碍的相关遗传疾病的风险，还可为个体化用量补服叶酸及疗效观察提供更可靠依据[18]，达到预防出生缺陷的目的。

综上所述，本研究通过对南宁市1338例孕前育龄妇女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突变检测，能全面发现孕前育龄妇女叶酸代谢能力障碍的相关遗传疾病风险，可为指导孕前育龄妇女预防和干预婴儿出生缺陷提供可靠依据，在出生缺陷防控技术应用中有重要的价值。

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（收稿日期：2018-12-28）

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