红肉蜜柚PDR型转运蛋白基因的发掘及CmPDR11—2表达与耐草甘膦初步分析
摘 要 基于红肉蜜柚RNA-seq数据库，筛选出50个ABC转运蛋白家族基因，其中包含11条PDR型基因。对11条柚PDR基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明：CmPDR11-2编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的AtPDR11基因同源性最高，达69.25%，利用RT-PCR技术克隆得到CmPDR11-2的ORF序列。该序列长度为4 371 bp，编码一个含有1 456个氨基酸的蛋白质，分子量165.138 03 ku，该蛋白属于稳定的亲水性蛋白，无信号肽，具有12个跨膜结构，定位于细胞膜。实时荧光定量PCR结果表明，草甘膦除草剂胁迫处理条件下，1～15 d处理组柚叶的CmPDR11-2基因相对表达量呈整体上升趋势，且均高于对照组，反应迅速且持久，这表明CmPDR11-2基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。
关键词 红肉蜜柚；PDR；CmPDR11-2；克隆；实时荧光定量PCR
中图分类号 S682 文献标识码 A
Abstract Based on the RNA-seq database of ‘Hongrou miyou’50 ABC transporter family genes were screened， including 11 PDR type genes. The nomenclature and bioinformatics analysis of 11 pomelo PDR genes were carried out. Homology analysis showed that the amino acid sequence encoded by CmPDR11-2 had the highest homology （69.25%） with the AtPDR11 gene that transports paraquat herbicides in Arabidopsis. The ORF of PDR gene was named as CmPDR11-2， which was a full-length of 4 371 bp， encoding a 1 456 amino acids with molecular weight 165.138 03 ku. The protein was stably hydrophilic， without signal peptide， with 12 transmembrane structure located in cell membrane. The results of real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that under the condition of glyphosate herbicide stress， the relative expression of CmPDR11-2 in the leaves treated with glyphosate for 1–15 days showed an overall upward trend， both of which were higher than the control， and the reaction was rapid and durable. This indicated that the expression of CmPDR11-2 gene was related to ‘Hong rou mi you’ glyphosate tolerance.
Keywords Citrus maxima ‘Hongrou miyou’； PDR； CmPDR11-2； cloning； real-time fluorescence quantitative PCR
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.012
植物ABC轉运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters— ABC转运蛋白），是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族[1]，存在于植物细胞的质膜、液泡、线粒体和过氧化物酶体中[2]，参与植物细胞生命活动的多种过程，影响产量和品质形成[3]。根据HAGO系统（基于越橘转录组测序的PDR转运蛋白基因的发掘及其表达分析）命名法，植物ABC转运蛋白基因分为八大亚族：ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG和ABCH[4]，不过目前在植物中未发现ABCH亚家族成员[5]，在拟南芥中，Kang等[6]将更简单的ABC转运蛋白命名为细菌型的ABCI家族。其中ABCG是最大的亚族，包含WBC（White-brown complex homologue）和PDR（Pleiotropic drug resistance）2种类型[7]。水生植物浮萍SpTUR2是第一个被鉴定的PDR基因[8]，随后研究人员分别在拟南芥中鉴定出15个PDR转运蛋白基因，水稻中鉴定出23个[9]，越橘中鉴定出21个[10]，近年来随着基因克隆技术的发展，小麦、苜蓿和大豆等PDR基因也被克隆和鉴定出[11-14]。研究发现，PDR蛋白家族在植物生长素的极性转运、脂质的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和气孔的功能调节等一系列过程中都发挥作用，因而备受人们关注[15]。
我国是世界上柚类生产面积最大的国家，柚子营养价值丰富，品种多，可以迎合不同人的口味需求，具有重要的农业价值和经济价值。杂草是柑橘类果树种植过程中的大敌，因杂草造成的减产一般达10%～20%，严重时达50%以上[16]。面对疯长的杂草，化学除草剂如草甘膦因其方便、省事、省工，成为许多柑橘果农的首选。草甘膦能直接杀死杂草的根系，但如果长期施用除草剂，会降低土壤有效Fe和Zn的含量，并抑制柑橘对Fe和Zn的吸收。草甘膦在清除杂草的同时，也影响到了柑橘树体的生长，主要表现为抑制蛋白质的合成[17]，而且若由于操作不当或喷药时产生大量的药雾随风漂移，可由果树叶片直接吸收并传导到根系，造成果树伤根及土壤污染板结，根系吸水吸肥能力减弱甚至消失，出现严重败根黄叶，甚至枯死[18]。所以为保证果实产量和品质，在柚子生产过程中，应尽量降低草甘膦造成的不良影响。