番茄青枯病植物疫苗胶悬菌剂的制备及其对病害的防治效果
材料与方法
1.1 供试材料
青枯雷尔氏菌无致病力菌株FJAT1458分离自感染番茄青枯病的田块中表现健康的植株，由福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库收集保存。生物杀菌剂20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂，由福农生化有限公司提供；化学农药72%农用硫酸链霉素可溶粉剂，华北制药生产。培养青枯雷尔氏菌的固体培养基TTC的配制参照Kelman[5]，液体培养基为SPA（蔗糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.025 g，定容至1 L，pH 7.0）。50 L发酵罐（GUJS50 L型，镇江东方生物工程设备技术公司）。
1.2 菌株FJAT1458的发酵
将菌株FJAT1458在TTC平板上活化后，转接至SPA液体培养基中，30℃、170 r/min振荡培养24 h，培养液按1%接菌量接种到装有30 L发酵培养基的发酵罐中，控制发酵罐搅拌器转速为200 r/min、在28～30℃下发酵48 h，然后转入无菌容器中，4℃保存备用。
1.3 发酵液的耐盐性测定
在发酵液中加入NaCl， 设置发酵液中NaCl的终浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%和7.0%，以不加NaCl为对照。常温放置，处理后5 d取样，涂布TTC平板，培养48 h后，统计平板上FJAT1458的活菌数量。
1.4 发酵液的耐酸碱性测定
将发酵液pH分别调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0（用1 mol/L HCl调节酸性，1 mol/L NaOH调节碱性），常温放置5 d后取样，涂布TTC平板，30℃培养48 h后，统计平板上FJAT1458的活菌数量，分析FJAT1458发酵液对酸碱的耐受力。
1.5 菌株FJAT1458发酵液胶悬剂的制备
配制1%琼脂液，调pH=7.0，121℃高压20 min，冷却至40～50℃时，按琼脂终浓度为1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰和3.0‰ 将琼脂液和菌株FJAT1458发酵液（pH 7.0，NaCl浓度为2%）混匀，静置24 h，观察胶悬剂（含菌量2.0×108 cfu/mL）的物理特性（包括均匀度、分层与否等）。
1.6 田间试验
试验地点设在福建省福鼎市蕉宕村绿禾盛有限公司番茄种植大棚，常年发生青枯病，试验选用的番茄品种为‘蓓盈’。
试验共设4个处理。（1）植物疫苗胶悬剂处理：番茄育苗时，用植物疫苗胶悬剂100倍液与育苗基质按1∶40混合拌匀；移栽时，用植物疫苗胶悬剂500倍液灌根，200 mL/株，之后，每个月再按移栽时的方法灌根1次。（2）生防菌处理：番茄育苗时，用生物杀菌剂20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP 300倍液与育苗基质按1∶40混合拌匀；移栽时，用20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP 300倍液灌根，200 mL/株，之后，每个月再按移栽时的方法灌根1次。（3）常规化学农药处理：番茄育苗时，用72%农用硫酸链霉素SP 2 000倍液与育苗基质按1∶40混合拌匀；移栽时，用72%农用硫酸链霉素SP 5 000倍液灌根，200 mL/株，之后，每個月再按移栽时的方法灌根1次。（4）植物疫苗配合生防菌处理：番茄育苗时，将植物疫苗胶悬剂100倍液与20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP 300倍液按1∶1配成混合液，然后将混合液与育苗基质按1∶40混合拌匀；移栽时，将植物疫苗胶悬剂500倍液与20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP 300倍液按1∶1配成混合液，然后用混合液灌根，200 mL/株，之后，每个月再按移栽时的方法灌根1次。以清水代替生防菌剂或化学农药对番茄苗进行同样处理作为对照。每处理及对照均设3个重复，每重复667 m2，田间随机排列；处理及对照的水、肥等管理按常规方法进行。处理后90 d（结果期）进行番茄青枯病田间病情调查，统计不同处理下番茄青枯病的田间发病率，计算各处理的防治效果。发病率（%）=（发病株数/总株数）×100，防效（%）=[1-（发病株数/总株数）]×100；同时，调查植株的株高和挂果率，每处理测量50株，取平均值。
2 结果与分析
2.1 菌株FJAT1458的耐盐性
不同盐浓度处理下，菌株FJAT1458发酵液中活菌数呈现一定的变化规律（图1），在氯化钠浓度大于5.5%时，菌株FJAT1458不能存活。添加的氯化钠浓度为2%时发酵液中活菌数与对照相当，为3.5×108 cfu/mL，而氯化钠浓度在3.0%～5.0%时，菌株FJAT1458发酵液中菌体数量随盐浓度增加而减少，说明在FJAT1458发酵液中添加一定量的氯化钠（2%）有利于菌株的存活，但添加量过多也会导致菌株FJAT1458的死亡。
2.2 菌株FJAT1458的耐酸碱性
菌株FJAT1458的发酵液在pH 7～8条件下菌体数最多，在弱碱性（pH为9）条件下能存活，但活菌数量明显低于中性条件，在pH大于10和小于4条件下均不能存活，在弱酸性pH 4～6条件下能存活，菌量大于其在弱碱性条件下的存活量（图2）。
2.3 菌株FJAT1458的胶悬剂制备
在菌株FJAT1458的发酵液（pH 7.0，NaCl浓度2%）中添加不同浓度的水琼脂，制备植物疫苗胶悬剂，结果表明，琼脂终浓度为1‰的胶悬剂会上下分层，琼脂终浓度为3‰时会凝固成块，琼脂终浓度为2.5‰的胶悬剂出现较大的颗粒状，琼脂终浓度为1.5‰和2‰的胶悬剂效果最好，质地均匀，无上下分层（图3）。
2.4 不同处理对番茄植株田间生长的影响
由表1可见，植株疫苗处理的番茄植株的株高（48.41 cm）略高于生防菌剂20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP处理（46.83 cm）、植物疫苗配合20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP处理（46.54 cm）及对照组的番茄植株的株高（46.54 cm），但他们之间差异不显著。72%农用硫酸链霉素SP处理对番茄植株生长有一定的抑制作用，株高为40.68 cm，显著低于上述各种处理及对照。
植物疫苗处理的番茄植株的挂果数与植物疫苗配合20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP处理及对照组相当，分别为25.80、25.40和25.20个；20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP处理和72%农用硫酸链霉素SP处理的番茄植株挂果数分别为21.40和20.20个，显著低于植物疫苗、植物疫苗配合20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP和对照组番茄植株的挂果数。
2.5 不同处理对番茄植株发病率的影响
植物疫苗、生防菌剂20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP和化学农药72%农用硫酸链霉素SP对番茄青枯病的防治效果不同，植物疫苗配合20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP处理对番茄青枯病的防效最好，达81.81%，其次是植物疫苗单独处理，其对番茄青枯病的防效为77.45%，与72%农用硫酸链霉素SP的防效（77.23%）相当，20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP单独处理对番茄青枯病的防效（72.77%）低于植物疫苗和72%农用硫酸链霉素SP处理，但差异不显著（表2）。
3 讨论
胶悬剂又叫悬浮剂，是以水为介质，以表面活性剂等作分散物，利用湿法进行超微粉碎制成的黏稠可流动的悬浮液，具有粒子小、表面活性大、药效高、渗透力强等优点。胶悬剂在化学农药生产中应用较多，一些农药胶悬剂已实现商品化[6]，如40%多菌灵胶悬剂[7]，在一些生物制剂中也有商品化应用，如美国陶氏化学有限公司在中国登记的2.5%多杀菌素胶悬剂（商品名菜喜）是从土壤放线菌次生代谢物中分离提纯出来的一种新型杀虫剂[8]。目前常用的农药胶悬剂的表面活性剂有：（1）非离子型，如烷基酚聚氧乙烯醚类等；（2）阴离子表面活性剂，如烷基苯磺酸盐类等；（3）阳离子表面活性剂，如烷基铵盐型等。本研究利用琼脂的胶悬作用，将植物疫苗菌株FJAT1458的发酵液制备成胶悬剂，结果表明，当琼脂浓度为1.5‰或2‰时，制备的植物疫苗胶悬剂的胶悬效果最好，质地均匀，无大颗粒出现、无上下分层，可以在后期的产品制备时应用，该方法制备的植物疫苗胶悬剂具有操作简单、制作成本低、使用方便，对环境安全等优点。
在生物制剂中添加适量的氯化钠可阻止其受到杂菌的污染。还可起到调节菌体细胞渗透压的作用，使菌体浓度维持一定的稳定性，但是氯化钠浓度不能过高，否则会抑制菌的生长和活性。本研究发现，当植物疫苗菌株FJAT1458的发酵液中添加盐的浓度为2%时，所含FJAT1458的活菌量最多，但随着盐浓度的增加，FJAT1458的生长受到抑制，盐浓度超过5.5%时，FJAT1458完全不能生长，因而建议在进行植物疫苗菌剂的制备时盐的添加量控制在2%以内，这样可以更好地保持菌的活性。
pH（酸碱度）是影响微生物生长的重要因素，与微生物的生命活动有着密切的联系。pH不仅会影响微生物细胞膜所带的电荷，进而影响细胞对营养物质吸收，此外，它还通过改变培养基中一些有機化合物的离子化程度，而改变其溶解性，从而促进或抑制微生物的生长[9]。大部分微生物适宜在中性环境下生长，本研究发现植物疫苗菌株FJAT1458的发酵液在pH 7～8的中性条件下活菌数最多，pH大于10和小于4均会抑制菌株生长。
番茄青枯病植物疫苗胶悬剂能较好地抑制番茄青枯病的发生，其防效与化学农药72%农用硫酸链霉素SP相当，配合生防菌剂20亿活芽孢/g蜡质芽孢杆菌WP施用，效果更佳。植物疫苗制剂对番茄植株具有促进生长作用，单独施用或配合生防菌施用，番茄植株的株高和挂果率均显著高于72%农用硫酸链霉素SP处理，说明植物疫苗制剂本身对番茄植株不会产生药害，具有安全无毒、无药残、对环境友好，符合无公害农业生产的标准，可以在生产上应用。
参考文献
[1] Hibberd A M， Heaton J B， Finlay G P， et al. A plastic film greenhouse method for selecting tomato seedlings resistance to bacterial canker [J]. Plant Disease， 1992， 76（10）： 10041007.
[2] 肖烨， 洪艳云， 易图永， 等. 番茄青枯病生物防治研究进展[J]. 植物保护， 2007， 33（2）： 1520.
[3] 邱德文. 植物免疫与植物疫苗——研究与实践[M]. 北京： 科学出版社， 2008.
[4] 郑雪芳， 刘波， 林乃铨， 等. 青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析[J]. 植物病理学报， 2013， 43（5）： 518531.
[5] Kelman A. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium[J]. Phytopathology， 1954， 44： 693695.
[6] 章大诩， 王广远. 灭蚊球孢菌胶悬剂的研制[J]. 农药， 1997， 36（4）： 1214.
[7] 姚浩然， 李勇， 李静， 等. 杀菌剂新剂型——“40%多菌灵胶悬剂”防治大豆灰斑病研究[J]. 大豆科学， 1989， 8（1）： 7585.
[8] 刘敏艳， 李玉奇， 胡冠芳. 2.5%菜喜胶悬剂对甘蓝小菜蛾和菜青虫的防效[J]. 甘肃农业科技， 2007（8）： 1921.
[9] 陈燕飞. pH对微生物的影响[J]. 太原师范学院学报（自然科学版）， 2009， 8（3）： 121124.
（责任编辑：杨明丽）
下一篇：毒芹诱导分化培养基筛选