TNF—α、COX—2、P53及CK7在Barrett食管中的表达及其意义分析
【摘要】 目的 探索研究腫瘤坏死因子-α（TNF-α）、环氧化酶-2（COX-2）、P53以及细胞角蛋白7（CK7）在Barrett食管（BE）中的表达情况， 分析其变化的意义。方法 38例明确BE诊断患者， 通过免疫组织化学对BE患者术后组织进行切片染色， 将患者BE病变区域组织设为BE组（42例）， 将BE边缘食管炎部分组织作为食管炎组（27例）， 将BE病变部位外5 cm正常食管黏膜作为正常组（29例）。比较三组TNF-α、COX-2、P53及CK7的表达情况。结果 正常组TNF-α阳性率为20.7%， 食管炎组为92.6%， BE组为81.0%， 正常组TNF-α阳性率低于食管炎组、BE组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；食管炎组和BE组TNF-α阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。正常组COX-2阳性率低于食管炎组、BE组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；食管炎组和BE组COX-2阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。正常组P53蛋白阳性率低于食管炎组、BE组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；BE组P53蛋白阳性率高于食管炎组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。正常组、食管炎组CK7蛋白阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）， BE组CK7蛋白阳性率均高于正常组和食管炎组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 TNF-α、COX-2、P53及CK7与BE的发生具有密切联系， 通过检测其表达量能够对BE诊断提供一定指导意义。
【关键词】 肿瘤坏死因子-α；环氧化酶-2；P53；细胞角蛋白7；Barrett食管
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.002
【Abstract】 Objective To explore and study the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， P53， cytokeratin 7 （CK7） in Barrett esophagus （BE）， and analyze the significance of their changes. Methods A total of 38 confirmed BE patients， and their postoperative tissue was stained by immunohistochemistry. The BE lesion tissue was taken as group BE （38 cases）， the BE marginal esophagitis tissue was taken as esophagitis group （27 cases）， and the normal esophageal mucosa of 5 cm outside the site of BE lesion was taken as normal group （29 cases）. Comparison were made on expression of TNF-α， COX-2， P53 and CK7 in three groups. Results The normal group had TNF-α positive rate as 20.7%， which was 92.6% in esophagitis group and 81.0% in BE group. The normal group had lower TNF-α positive rate than esophagitis group and BE group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The esophagitis group and BE group had no no statistically significant difference in TNF-α positive rate （P>0.05）. The normal group had lower COX-2 positive rate than the esophagitis group and BE group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The esophagitis group and BE group had no no statistically significant difference in COX-2 positive rate （P>0.05）. The normal group had lower P53 protein positive rate than the esophagitis group and BE group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The BE group had higher P53 protein positive rate than the esophagitis group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. The normal group and esophagitis group had no statistically significant difference in CK7 protein positive rate （P>0.05）. The BE group had higher CK7 protein positive rate than the normal group and esophagitis group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion TNF- α， COX-2， P53 and CK7 are closely related to the BE development， and the detection of their expression can provide some guidance for the diagnosis of Barrett esophagus.
【Key words】 Tumor necrosis factor-α； Cyclooxygenase-2； P53；Cytokeratin 7； Barrett esophagus
BE是食管癌的主要癌前病变， 其主要病理表现为食管鳞状上皮细胞化生为柱状上皮， 目前认为与食管癌的发生具有密切联系[1]。目前对于BE的诊断主要依靠通过组织活检发现柱状上皮， 但是有时病理观察很难发现杯状上皮与柱状上皮之间的差异， 因此很难进行准确诊断[2]。本研究主要通过研究TNF-α、COX-2、P53、CK7等在BE中的表达情况， 探索其在临床应用中的意义。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选择本校第一附属医院2015年4月～2017年3月收治的38例明确BE诊断患者为研究对象， 其中男29例， 女9例， 患者年龄30～72岁， 平均年龄（48.2±14.3）岁。将患者BE病变区域组织设为BE组， 将BE边缘食管炎部分组织作为食管炎组， 将BE病变部位外5 cm正常食管黏膜作为正常组。BE诊断标准[3]：①胃镜检查下胃和食管连接处近端局部出现红色柱状上皮区域（见图1）， 在疑似病变区域取1～2块组织进行病理检查， 病理检查结果显示为典型柱状上皮。②患者病理检查结果排除食管癌。
1. 2 方法 将BE患者手术标本或蜡块存档组织采用10%福尔马林进行固定， 采用梯度酒精对组织进行脱水， 对蜡块存档组织进行常规脱蜡。采用石蜡对组织进行包埋， 之后进行石蜡组织切片， 切片厚度为4 μm， 同一部位连续切片6张。将载玻片进行 3-氨丙基-3-甲氧基硅烷（APEs）防脱片处理， 将切片后组织置于载玻片上， 通过显微镜观察组织形态。将组织采用磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤， 分别将TNF-α、COX-2、P53蛋白、CK7抗体分别加在不同切片表面， 4℃环境下孵育抗体过夜。孵完一抗后将切片用PBS清洗4次， 5 min/次。组织片孵育二抗， 二抗为山羊抗兔免疫球蛋白G
（IgG）， 37℃环境下孵育30 min， 之后将组织片进行二氨基联苯胺（DAB）显色苏木素复染。复染后对组织片进行脱水、透明等处理， 之后用封片剂对组织进行封片， 通过显微镜进行观察。正常组、食管炎组、BE组有效例数分别为29、27、42例。
1. 3 观察指标及判定标准 观察三组TNF-α、COX-2、P53及CK7蛋白在正常食管黏膜、慢性食管炎以及BE部位的表达情况。经过DAB顯色后TNF-α、COX-2、P53、CK7蛋白会呈现棕褐色或棕黄色， 呈颗粒状分布在细胞包浆、细胞膜以及细胞核内。根据细胞染色情况进行判定， 染色细胞数目为0视为阴性， 记为阴性（-）， 1%～25%细胞染色视为弱阳性阳性， 记为（+）；染色细胞占26%～50%视为阳性， 记为（++）；染色细胞数目>50%视为强阳性， 记为（+++）。将（++）、（+++）视为高表达， 阳性（+）视为低表达。
1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 TNF-α表达情况 TNF-α蛋白经过染色后呈棕黄色， 正常组TNF-α阳性率为20.7%， 食管炎组为92.6%， BE组为81.0%， 正常组TNF-α阳性率低于食管炎组、BE组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；食管炎组和BE组TNF-α阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2. 2 COX-2表达情况 COX-2蛋白经过染色后呈棕黄色， 主要分布在表层上皮细胞以及发生化生的腺上皮细胞中。正常组COX-2阳性率为10.3%， 食管炎组为74.1%， BE组为83.3%， 正常组COX-2阳性率低于食管炎组、BE组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；食管炎组和BE组COX-2阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2. 3 P53蛋白表达情况 P53蛋白经染色后呈棕黄色， 正常组P53蛋白阳性率为13.8%， 食管炎组为40.7%， BE组为71.4%， 正常组P53蛋白阳性率低于食管炎组、BE组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；BE组P53蛋白阳性率高于食管炎组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。
2. 4 CK7蛋白表达情况 CK7蛋白经染色后呈棕黄色， 正常组CK7蛋白阳性率为0， 食管炎组为7.4%， BE组为95.2%， 正常组、食管炎组CK7蛋白阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）， BE组CK7蛋白阳性率均高于正常组和食管炎组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表4。
3 讨论
TNF-α存在于正常细胞中， 是维持机体内环境稳定的重要细胞因子， 主要由巨噬细胞和淋巴细胞释放。在炎症反应中， 巨噬细胞和淋巴细胞激活， 会引起局部组织TNF-α水平增高[4]。本次研究中食管炎组和BE组TNF-α水平明显较正常组高（P<0.05）， 说明BE病变部位发生炎性反应， 造成病变部位TNF-α水平增高， 食管慢性炎症是BE前期症状， 其TNF-α增高说明食管慢性炎症是BE发展过程中的炎性改变。COX是合成前列腺素（PGs）重要的酶[5]， COX-2是COX同工酶， 在正常组织中COX-2表达量极低， 几乎检测不到[6]。PGs是一种炎性因子， 当组织发生炎症反应时， 炎性细胞增多COX-2表达量增多， 促进PGs表达量增多， BE组和慢性食管炎组COX-2增多， 说明病变部位发生明显炎症反应， 因此说明慢性炎症反应是BE的早期事件。P53基因是抑癌基因的一种[7]， P53蛋白是一种负性调节因子， 在DNA修复以及细胞增殖分化过程中具有重要作用， 在正常组织中P53蛋白会少量表达， 而在肿瘤细胞中P53会出现过表达情况， 本次研究中， 正常组中P53表达量明显低于其他两组， 而BE组P53又明显高于食管炎组（P<0.05）。由于BE为食管癌癌前病变， 因此BE病变部位P53会出现明显上调， 从P53变化趋势可以看出从慢性食管炎到BE再到食管癌是食管癌发展的重要过程。CK7是一种碱性角蛋白， 在鳞状上皮细胞中不表达而在腺上皮细胞中表达量较高[8-10]， 因此通过CK7可以反映食管上皮细胞是否发生肠上皮化生。本实验中， 正常组CK7阴性， 说明正常食管上皮中不存在肠上皮化生， 而BE组CK7蛋白明显增加， 说明BE病变虽未出现癌变， 但是其已经发生肠上皮化生。
综上所述， TNF-α、COX-2、P53以及CK7在BE中均出现过表达， 因此可以通过检测这些指标对患者病情进行评估， 对临床治疗以及评估预后具有指导意义。
参考文献
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[收稿日期：2017-05-27]