生长抑素施他宁对结肠癌SW480细胞生长抑制和凋亡作用的实验研究
【摘要】目的:探讨应用生长抑素类似物施他宁对人结肠癌细胞株SW480细胞的生长抑制和凋亡作用，及细胞周期的影响。方法：采用MTT比色法测定不同浓度施他宁对SW480细胞增殖的抑制作用；流式细胞仪测定SW480细胞细胞周期分布、增殖指数、凋亡率。结果：生长抑素施他宁能够明显抑制人结肠癌细胞株SW480细胞增殖（P<0.01），且呈浓度和时间依赖性（P<0.01，P<0.01）。结论：生长抑素施他宁可抑制人结肠癌细胞株SW480的生长；生长抑素可能通过抑制G1/G2期SW480细胞进入S期及促进细胞凋亡两种途径抑制人结肠癌细胞株SW480增殖，影响其凋亡。
【关键词】生长抑素；结肠癌；增殖；凋亡；奥沙利铂
【中图分类号】R735.35【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0095-02
随着我国人均寿命的延长，大肠癌发病率逐年升高，大肠癌已成为当前我国癌症病人死亡的主要疾病之一[1]，预后较差。而其早期诊断和根治办法尚未有突破性进展，开展对大肠癌发病机制和临床干预的研究，是目前大肠癌临床治疗的迫切要求。大肠癌临床化疗方案选择上，常规化疗药物因其毒副作用而受到限制。近年来临床发现非细胞毒性抗肿瘤药物如生长抑素（somatostatin，SST）类似物等对肿瘤细胞有抑制增殖、促进凋亡作用。本研究通过观察生长抑素施他宁对人结肠癌细胞SW480细胞的增殖凋亡有无影响，为临床治疗肿瘤提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂和仪器:SW480人结肠腺癌细胞株（中国科学院上海细胞生物所）；注射用生长抑素施他宁（瑞士雪兰诺公司）；小牛血清（浙江省杭州四季青生物公司）；四甲基噻唑氮蓝（MTT，Fluka公司）；二甲基亚枫（SIGMA公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；RPMI1640（GIBCO公司）；Bio-Tek酶联免疫检测仪（PE公司，型号ELX-800）；流式细胞仪（Bechman Coulter公司，EPICS-XL型）。
1.2 实验方法
1.2.1 SW480细胞培养:SW480细胞用RPMI 1640培养液加10%小牛血清，置于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。实验取对数生长期细胞，胰酶消化，制成细胞悬液。普通光镜400倍观察细胞形态变化。
1.2.2 MTT法检测SW480细胞增殖：实验分为空白对照组，溶媒对照组和施他宁药物处理组（1,2,5,10,50μg/ml），每组设3个复孔，以不含细胞的RPMI 1640培养液为空白对照组（调零组），各组细胞按不同处理后培养24、48、72 h，检测时加入20μl MTT（浓度为5mg/ml），继续孵育4 h，弃上清后每孔加二亚基甲砜150μl，振荡溶解，酶联检测仪测定570 nm波长处的光吸收值OD 值（570）。细胞增殖抑制率按下列公式计算：细胞抑制率（%）[对照组OD－实验组OD]/对照组OD×100%。
1.2.3 流式细胞仪测定SW480细胞周期及增殖指数：取常规传代的SW480细胞，每组3瓶，用含0.1%小牛血清的RPMI-1640培养基处理24h进行细胞周期同步化后，分别加入不同浓度的药物。培养24小时对数生长期收集细胞，2000r/min，离心10分钟，弃上清液，振荡，无菌PBS洗涤,重复3次.振荡后加入-4℃的95%乙醇1ml固定,上流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率。
1.3 统计学方法:应用SPSS12.0统计软件，数据以均数±标准差（x±s）表示,采用单因素方差分析和t检验，检验水准取α0.05；采用LSD（Least Significant Difference Test）检验法进行组间两两多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 施他宁对SW480细胞增殖的抑制作用普通光镜400倍观察经施他宁处理的人结肠癌SW480细胞数量减少,部分细胞体积缩小,细胞膜完整,胞浆浓缩,核染色质固缩,细胞核碎裂（图1，2）；MTT法检测显示施他宁对人结肠癌SW480细胞的增殖有抑制作用,其抑制作用随着作用浓度的增加和作用时间的延长而增强。施他宁有效抑制结肠癌SW480细胞的生长，在一定浓度时间范围内，细胞增殖抑制作用随着浓度增加、时间延长而加强，呈明显的量-效、时-效关系（P<0.01，P<0.05） （表1）。
2.2 施他宁诱导SW480细胞凋亡:流式细胞仪分析结果显示，施他宁处理SW480细胞24 h后，出现G1期凋亡的亚二倍体峰。施他宁处理组随浓度增高、时间延长与对照组相比凋亡率明显升高（图3，4）。用单因素方差分析（One Way ANOV）比较两组细胞凋亡的百分率细胞周期的分布改变，结果表明5μg/ml以上浓度的施他宁组SW480细胞凋亡率较空白对照有明显升高，差异有显著性意义（P0.000<0.01）（表2）。
2.3 施他宁处理后SW480细胞周期的结果分析:施他宁组处理SW480细胞24 h后，细胞周期分布G1/G2期细胞明显增多，S期细胞减少，施他宁与对照组之间的细胞周期分布差异有统计学意义（P0.000<0.01） （表3）。细胞周期的分布检测结果显示施他宁能抑制结肠癌SW480细胞的增殖，诱导其凋亡，使其细胞周期受阻于G1/G2期,并在一定范围内呈浓度与时间依赖性。说明施他宁将SW480细胞阻滞在G1/G2期，并且促进G1期细胞凋亡。
表1 MTT法测定施他宁对SW480细胞增殖的影响（x±s，n3）
备注：* vs controlP<0.01
3 讨论
近年来研究发现，许多人体组织细胞生长受体内外激素调节，且这些组织发生的肿瘤依然受激素控制。大肠肿瘤的发病是一个多因素、多步骤、多阶段、多基因参与的复杂过程，其中胃肠激素异常表达导致细胞增殖、凋亡失衡是重要因素之一。大肠癌的治疗目前是以手术治疗为主，放疗、化疗为辅。内分泌治疗早期应用于乳腺癌，但是否适合于大肠癌目前仍处于理论研究阶段，其中生长抑素类似物是非常有希望的内分泌治疗候选药物。8肽生长抑素在体外实验中证明对结肠癌有明显抑制作用。Chen等[2]用八肽生长抑素类似物奥曲肽处理结肠癌SW480细胞，结果发现奥曲肽对SW480细胞具有明显的抗增殖及诱导凋亡作用，且呈剂量依赖性及时间依赖性，并伴有细胞周期阻滞，G0/G1期细胞明显增加，这与本研究中14肽生长抑素类似物施他宁对SW480细胞的作用结果相似。
表2 流式细胞仪测定施他宁对SW480细胞的凋亡率（x±s，n3）
备注：※ vs controlP<0.01；▲vs NS control P<0.01。ANOVA值：F96.195， P0.000。
表3 流式细胞仪测定施他宁对SW480细胞周期影响（24h,48h）
备注：※vs control P<0.01; ▲vs NS control P<0.01；n3。
生长抑素是胃肠道重要激素之一，它具有抑制胃肠道粘膜细胞生长的作用。14肽生长抑素类似物施他宁能否对消化道肿瘤的增殖凋亡有相关作用，目前国内外尚少有相关报道。生长抑素可以通过G蛋白耦联受体家族直接调控细胞的分泌及增殖，也可以通过抑制促有丝分裂的激素和生长因子的分泌达到间接抗肿瘤的作用[3]。国外研究表明应用生长抑素及其类似物能明显抑制许多大肠癌细胞株的生长，但对于其受体阴性的肿瘤细胞株并无作用，表明生长抑素发挥抗增殖作用主要是通过于其受体结合而实现。国外Radulovic等[4]报道大肠癌上生长抑素受体高表达。国内董涛涛等[5]报道大肠癌上生长抑素Ⅱ受体在32例原发的大肠肿瘤组织中均有表达。大肠癌细胞能产生和分泌可促进或抑制其生长的胃肠激素，而其细胞膜上同时具有该激素的受体，这样肿瘤细胞产生和分泌的促生长性或抑制生长性的激素作用于自身细胞受体，从而发挥其生物效应.通过阻断大肠癌的自馈性调节或促进自控性调节机制，可用于大肠癌的内分泌治疗生长抑素施他宁是一种含有14肽的环状多肽类激素，人体内分布甚广，广泛存在于脑、垂体、胰腺、胃肠道、肾上腺及免疫系统中，由特殊的内分泌细胞-D细胞合成和释放。生长抑素主要调节内分泌及外分泌系统激素的分泌，并在调节人体多种激素的分泌过程中发挥重要作用。目前临床广泛用于治疗消化道出血，胰腺炎，内分泌肿瘤及胃肠胰肿瘤。生长抑素可抑制多种促消化系统肿瘤生长作用的激素分泌，如胃泌素、CCK、蛙皮索等的分泌；亦可直接或间接抑制一些自分泌或旁分泌生长因子的产生。
施他宁抑制肿瘤生长的机制目前尚不清楚，可能的机制为细胞周期途径。细胞周期是指细胞从上一次分裂结束开始到下一次细胞分裂结束的整个过程，细胞周期调控异常是细胞过度增殖和肿瘤发生的重要原因[6]。大肠癌的发生涉及多因素、多步骤、多阶段、多基因突变，但最后都归结为一个共同环节-细胞周期机制的破坏，故众多学者把肿瘤称为细胞周期性疾病[7-9]。肿瘤细胞增殖是由于细胞周期调控失衡所致，因此通过诱导细胞周期阻滞可以抑制肿瘤细胞增殖。细胞周期分为G1、S、G2、M期4个连续阶段，细胞周期的运行与否，能否按序完成细胞周期，受控于精密的细胞周期调控机制。细胞周期有2个调控点，分别是G1/S调控点和G2/M调控点。G1/S调控点在哺乳动物中又称限制点（R点），它决定细胞是进入S期还是退出细胞周期再进入G0期（静止期），是细胞周期的主要调控点。因此，对G1/S调控点的调控是对细胞周期进行调控的关键。阻断癌细胞从G1/G2期进入到S期和M期，从而抑制癌细胞的分裂和增殖。本实验显示，施他宁可影响SW480细胞周期中各期的比例，使细胞G1/G2期比例增高，S期比例降低，抑制肿瘤细胞的生长，提示施他宁可通过细胞周期途径产生协同抗肿瘤作用。
生长抑素具有免疫调节功能，是神经内分泌免疫网络中重要的信号转导分子。生长抑素及其类似物通过抑制淋巴细胞增殖、抑制白介素或细胞因子释放以及抑制NK活性等途径起到抗细胞增殖作用[10]。
综上所述，生长抑素类似物及生长抑素受体在抗肿瘤增殖和促进凋亡方面有一定的作用。目前已有大量关于生长抑素类似物抗肿瘤作用和机制的报道，但总体而言，其临床治疗的效果还不甚理想。除了与病例数判断标准、药物类型、剂量、治疗方案不同有关外，根本的原因在于生长抑素影响肿瘤细胞增殖的机制不明。生长抑素及其类似物的抗肿瘤机制可能主要通过以下两种途径发挥作用：（1）生长抑素及其类似物与受体结合而直接发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用；（2）生长抑素及其类似物通过抑制促肿瘤生长的细胞因子或激素的合成与分泌，抑制肿瘤血管形成，通过阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡或调节机体免疫活性等方面间接发挥抗肿瘤作用。
本研究通过对生长抑素施他宁对人结肠癌SW480细胞进行体外实验，结果证实施他宁可抑制结肠癌SW480细胞的增殖并诱导细胞凋亡，其对人结肠癌细胞有直接抑制作用。另生长抑素施他宁具有保护胃肠道黏膜，抑制消化酶分泌，不良副反应低等优点。本研究可能为大肠癌患者内分泌治疗提供一个广泛的前景，尤其是不能手术和不能耐受传统化疗药物治疗的大肠癌患者。但联合其它化疗药物治疗是否相互促进、药物动物实验及临床实验等还需深入研究证实。
参考文献
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