Survivin基因多态性与结直肠癌发病风险的相关性分析
【摘要】 目的：探讨Survivin基因多态性与结直肠癌发病风险的关联。方法：选取2013年1月-2015年5月本院收治的直肠癌患者186例作为研究组，同时选取健康者194例作为对照组。抽取两组患者外周血并使用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取DNA，采用聚合酶链式反应（PCR）和连接酶检测反应（LDR）对rs9904341C/G多态位点进行基因分型，比较两组的基因分型结果。结果：研究组C/C基因频率为44.62%，高于对照组的28.35%，C/G基因频率为39.78%，低于对照组的49.48%，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；G/G基因频率为15.59%，低于对照组的22.16%，比较差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，研究组Survivin C/G基因型的OR值为0.764（0.54～1.04）（P=0.020），C/C基因型的OR值为1.376（0.91～2.07）（P=0.031），G/G基因型的OR值为1.004（0.84～1.13）（P=0.121），携带C/G基因会降低患者的发病风险，而携带C/C基因则会升高发病危险。结论：Survivin基因多态性与结直肠癌发病风险有较高的关联性，为结直肠癌的诊断及探讨靶标相关miRNA多态作为结直肠癌风险个体识别的标志及其机制提供理论依据和实验基础，也意味着寻找和筛选与肿瘤发病风险密切相关的miRNA多态有望成为系统研究肿瘤早期诊断及发病机制的有效途径，因此具有广阔的实用价值和应用前景。
【关键词】 Survivin基因多态性； 结直肠癌； 发病风险
【Abstract】 Objective：To investigate the association of Survivin gene polymorphisms with the risk of colorectal cancer.Method：From January 2013 to May 2015，186 cases of rectal cancer in our hospital were selected as the research group and 194 cases of healthy persons were selected as control group at the same time.They were collected peripheral blood and extract DNA by using proteinase K digestion and saturated sodium chloride salting out method，and polymerase chain reaction （PCR），ligase detection reaction （LDR） were used for rs9904341C/G polymorphism genotyping，the genotyping results in two groups were compared.Result：The C/C
gene frequency was 44.62% in the research group，higher than 28.35% of the control group，C/G gene frequency was 39.78%，lower than 49.48% of the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The G/G gene frequency was 15.59%，lower than 22.16% of the control group，the difference was not statistically significant（P>0.05）.Compared with the control group，in the research group，the OR value of Survivin C/G gene was 0.764（0.54-1.04）（P=0.020），the OR value of Survivin C/C gene was 1.376（0.91-2.07）（P=0.031），the OR value of Survivin G/G gene was 1.004（0.84-1.13）（P=0.121）.The risk of colorectal cancer was reduced in the group with C/G gene，while was elevated in the group with C/C gene.Conclusion：Survivin gene polymorphism and risk of colorectal cancer have a higher relevance，for the diagnosis of colorectal cancer and explore the target miRNA polymorphism as a symbol of individual identification of colorectal cancer risk and its mechanism to provide theoretical and experimental basis，also means that finding and screening miRNA polymorphism closely related to the risk of cancer is expected to become the effective way of system for the study of tumor early diagnosis and pathogenic mechanism，so it has great practical value and broad application prospect.
【Key words】 Survivin gene polymorphism； Colorectal cancer； Risk of disease
First-author’s address：The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.002
结直肠癌（colorectal cancer，CRC），又称结肠直肠癌、大肠癌，包括肿瘤在大肠、直肠及阑尾的增生。一般认为，癌症起源于大肠中的腺瘤性瘜肉（Polyp）。作为消化道常见恶性肿瘤，结直肠癌发病率占胃肠道肿瘤的第2位。在世界范围内，结直肠癌是癌症死亡的第3大病因，其发病率在世界不同地区差异很大，以北美、大洋洲最高，欧洲居中，亚非地区较低。中国南方，特别是东南沿海地区高于北方。事实上，据估计2013年，仅美国地区就有50 000人因结肠癌死亡，而全球因结直肠癌死亡的病例可高达500 000人之多[1]。近年来，随着我国人民生活方式、饮食结构的改变及人口老龄化，我国结直肠癌的发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势，肿瘤的检出时间直接决定了结直肠癌患者的生存和预后。然而，由于结直肠癌在早期常常无明显症状，因此大部分患者确诊时均已属于晚期。手术仍然被公认是最有效的治疗结直肠癌的手段，然而统计结果显示局部淋巴结转移者的术后复发率仍高达50%。即使是不存在局部淋巴结转移的pN0结直肠癌患者，其复发率仍也高达25%。由于早期结直肠癌患者治疗后5年生存率约为90%，但晚期和转移性患者的总生存率仅为15%。因此，提高早期诊断率和进行风险预测对结直肠癌患者提高生存率和预后至关重要。结直肠癌也因其较高的发病率和死亡率而备受关注[2-6]。本研究旨在探讨Survivin基因多态性与结直肠癌发病风险之间的关联，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年1月-2015年5月本院收治的直肠癌患者186例作为研究组，其中男103例，女83例；年龄35～76岁，平均（47.8±5.7）岁。选取同期健康者194例作为对照组，其中男106例，女88例；年龄32～79岁，平均（48.1±6.1）岁。两组患者在性别、年龄等方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准。
1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）经临床确诊并通过病理学验证证实为直肠癌者；（2）各项功能性指标符合研究标准，即功能状态评分≥60者；（3）具有明确的可测量病灶者；（4）患者或其家属同意并签署知情同意书。排除标准：（1）对化疗药物不耐受者；（2）肝、肾功能存在异常者；（3）病情严重，预计生存期<5个月者。
1.3 仪器与试剂
1.3.1 仪器 离心机（LXJ-64-01，北京医疗仪器修理厂）、电子天平（PB3002-S，瑞士Mettler公司）、恒温磁力搅拌器（HJ-3，江苏金坛医疗仪器厂）、PCR扩增仪Mastercycler5333（Eppendorf company，Germany）、Eppendorf Research移液器（Eppendorf company，Germany）、ABI3730XL测序仪（上海生物工程有限公司）。
1.3.2 试剂 氯化镁（上海易佰聚生物公司）、dNTPs（Obiogene，Germany）、Taq-DNA聚合酶（上海生物工程有限公司）、100 bp DNA ladder（华美生物工程公司）、EDTA（美国Sigma）、引物合成（上海生物工程有限公司）、SDS（美国Sigma）、蛋白酶K
（德国Merck公司）、其他试剂均为分析纯
1.4 方法
1.4.1 外周血DNA提取 两组患者均采取侧卧位，取外周静脉血5 mL，加入抗凝剂摇匀后于4 ℃保存备用，于1周内提取DNA，具体过程如下：将与抗凝剂混合的血液样本加蒸馏水至50 mL，于2500 rpm离心10 min，去上层清夜，重复此操作3次。向沉淀物中加入0.1% Triton-X100同上离心，去上清后用蒸馏水洗涤1～2次。向沉淀物加3 mL DNA提取液，充分混合后加入10% SDS 150 μL，震荡至无凝块。加入蛋白酶K混合均匀，于37 ℃水浴中过夜。加入NaCl混合均匀后于2500 rpm离心15 min，取上层清液，使用乙醇洗涤1～2次，待乙醇挥发后用200 μL TE溶解，4 ℃下放置储存。
1.4.2 PCR反应 以DNA为模板使用聚合酶链反应扩增rs9904341基因序列。
1.4.3 引物设计及合成 使用Genetool软件设计Survivin基因上的多态性位点特异性核苷酸序列引物，rs9904341C/G 上游引物： 5，-CGCCTCTACTCCCAGAAGGC-3，，下游引物：5，-ACAGGAGAGCTTTACAGGGTG-3，。
1.4.4 LDR反应 95℃变性3 min，30个循环，每个循环2个温度，94 ℃ 30 s，56℃ 3 min。LDR序列包括：（1）S1-TC：CATTAACCGCCAGATTTGAATCGCC；
（2）S1-TG：TTTCATTAACCGCCAGATTTGAATCGCG；
（3）S1-TR：-P-GGACCCGTTGGCAGAGGTGGCGGCG-FAM-。LDR反应体系包括：PCR产物2 μL，10*Taq DNA ligase buffer 1μL；Taq DNA ligase（40 U/μL） 0.125 μL，探针（10p） 0.01 μL/条，蒸馏水补至
10 μL。
1.4.5 序列检测 使用ABI3730XL测序仪进行检测，取链接产物1 μL，加10 μL上样，95 ℃变性3 min，立即冰水浴。使用Genemapper进行数据分析。
1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析，再用Dunnett检验进行post-hoc分析，同时计算各位点OR值，衡量患病风险（OR值>1提示患病风险增加），以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组Survivin基因rs9904341C/G多态性与结直肠癌发病风险比较 研究组C/C基因频率为44.62%，高于对照组的28.35%，C/G基因频率为39.78%，低于对照组的49.48%，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；G/G基因频率为15.59%，低于对照组的22.16%，比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
2.2 两组Survivin基因rs9904341C/G多态性与结直肠癌发病风险相关性分析 携带C/G基因人群患结直肠癌的风险较低，其OR值为0.764（0.54～1.04）；携带C/C基因较C/G基因型人群患结直肠癌的风险较高，其OR值为1.376（0.91～2.07），见表2。
3 讨论
近年来，在结直肠癌诊断方面，各国科研人员都做了多方尝试，试图对结直肠癌的早期诊断、定位和分期进行更准确的诠释。目前，主要集中在肠道排泄物诊断法、结肠镜诊断法和影像学诊断法等，尽管如此，各国科学家一直以来从未停止寻找早期诊断和风险预测结直肠癌有效途径的脚步。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在人群中出现频率≥1%的先天突变，存在于整个基因组，是最常见的遗传变异[7]。作为第3代遗传标志，是miRNA参与肿瘤细胞生物学作用的调控机制之一。近年来，miRNA多态与肿瘤发病风险关系的报道日渐增多。研究认为，出现在pri-，pre-和成熟miRNA的多态均能够影响miRNA的功能，进而影响上百种基因及其通路蛋白的表达。与此同时，pri-miR-15a/miR-16 C/T多态被发现与家族性慢性淋巴细胞白血病的发病风险相关；Calin GA pre-mir-146a rs2910164 （G/C） SNP被认为与日本人群及中国人群的胃癌发病风险有关，且影响了成熟miR-146a的表达。这些越来越多的证据在提示SNP与肿瘤密切关系的同时，也意味着寻找和筛选与肿瘤发病风险密切相关的miRNA多态，将有望成为系统研究肿瘤早期诊断及发病机制的有效途径[8-12]。
微小核苷酸（microRNA，miRNA）做为非编码RNA中的一种，是真核生物中参与基因转录调控的18～23个核酸（nt）的单链RNA分子，通过碱基的完全或不完全互补，可与靶标基因的mRNA序列3，非编码区结合，从而使靶标的mRNA转录“沉默”或抑制（下调）[13-16]。正常生理状态下，miRNA具有调控细胞增殖、凋亡、分化与发育的重要作用。异常表达的miRNAs密切参与结直肠癌的增殖、分化、凋亡、转移、浸润及血管生成等发展过程。目前，血液抽提miRNA进行肿瘤早期预测在逐步开展，并展现了良好的应用前景[17]。
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymo-rphism，SNP）是指在人群中出现频率≥1%的先天突变，存在于整个基因组，是最常见的遗传变异。作为第3代遗传标志，是miRNA参与肿瘤细胞生物学作用的调控机制之一[18]。近年来，miRNA多态与肿瘤发病风险关系的报道日渐增多。研究认为，出现在pri-，pre-和成熟miRNA的多态均能够影响miRNA的功能，进而影响上百种基因及其通路蛋白的表达[19]。与此同时，pri-miR-15a/miR-16 C/T多态被发现与家族性慢性淋巴细胞白血病的发病风险相关；Calin GA pre-mir-146a rs2910164 （G/C） SNP被认为与日本人群及中国人群的胃癌发病风险有关，且影响了成熟miR-146a的表达。这些越来越多的证据提示SNP与肿瘤关系密切的同时，也意味着寻找和筛选与肿瘤发病风险密切相关的miRNA多态将有望成为系统研究肿瘤早期诊断及发病机制的有效途径[20]。
本文采用对比分析的方法，探讨rs9904341C/G
多态位点与结直肠癌发病风险的关联。结果表明研究组C/C基因频率为44.62%，高于对照组的28.35%，C/G基因频率为39.78%，低于对照组的49.48%，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；G/G基因频率为15.59%，低于对照组的22.16%，比较差异无统计学意义（P>0.05）。OR值的分析发现，与对照组比较，研究组C/C基因为1.376 （0.91～2.07），C/G基因为0.764（0.54～1.04），比较差异均有统计学意义（P<0.05），而G/G基因为1.004（0.84～1.13），比较差异无统计学意义（P>0.05）。由此可见，携带C/G基因会降低患者的发病风险，而携带C/C基因则会升高发病危险。本文的研究结果表明Survivin基因多态性与结直肠癌发病风险有较高的关联性，为结直肠癌的诊断及探讨靶标相关miRNA多态作为结直肠癌风险个体识别的标志及其机制提供理论依据和实验基础，也意味着寻找和筛选与肿瘤发病风险密切相关的miRNA多态有望成为系统研究肿瘤早期诊断及发病机制的有效途径，因此具有广阔的实用价值和应用前景。
参考文献
[1]庄天微，乔虹.PIK3CA、CCL5、Survivin基因与甲状腺癌相关性的新发现[J].标记免疫分析与临床，2014，21（1）：12-14.
[2]肖胤，杨军，肖林，等.Survivin基因多态性与肿瘤易感性的Meta分析[J].实用口腔医学杂志，2013，29（5）：668-672.
[3] Weitz J，Koch M，Debus J，et al.Colorectal cancer[J].Lancet，2005，365（9454）：1066-1066.
[4] Yang Y，Gu X，Zhou M，et al.Serum microRNAs：A new diagnostic method for colorectal cancer[J].Biomedical Reports，2013，1（4）：495-498.
[5]叶真逢，胡红林，习小庆.Survivin单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的关系探讨[J].山东医药，2012，52（14）：70-71.
[6]喻博，马静，隋军，等.Survivin基因多态性与肿瘤[J].国际肿瘤学杂志，2011，38（6）：409-411.
[7] Ryunosuke K，Koshi M，Fumiaki T，et al.Clinical significance of miR-146a in gastric cancer cases[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research，2011，17（13）：4277-4284.
[8]阮玉凤，孙璟，吴方，等.COX-2基因多态性与结直肠癌发病风险的关系研究[J].国际消化病杂志，2013，33（4）：260-263.
[9]倪勤，张勇晶，张善春，等.L-myc和H-ras基因多态性与结直肠癌发病风险的关系[J].中华肿瘤杂志，2012，34（1）：15-20.
[10]王丽，韦凤，聂伟伟，等.p73 4G14C-4A14T基因多态性与结直肠癌发病风险相关性的系统评价[J].肿瘤防治研究，2012，39（5）：526-531.
[11] Bond G L，Hu W，Bond E E，et al.A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans[J].Cell，2004，119（5）：591-602.
[12] Gellad Z F，Provenzale D.Colorectal cancer：national and international perspective on the burden of disease and public health impact[J].Revista Brasileira De Farmacognosia，2010，138（6）：2177-2190.
[13]张润虎，张树春，白涛.包头地区结直肠癌发病风险因素的病例对照研究[J].世界最新医学信息文摘（连续型电子期刊），2014，13（36）：11-12.
[14]李瑜元.高纤维膳食对降低结直肠癌发病风险的作用[J].胃肠病学，2014，15（7）：385-388.
[15] Anastasia K，Angela R，Jayasena S D.Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias[J].Cell，2003，115（2）：209-216.
[16] Ryan B M，Robles A I，Harris C C.Genetic variation in microRNA networks：the implications for cancer research[J].Nature Reviews Cancer，2010，10（6）：389-402.
[17] Sloane M A，Wong J W H，Dilmi P，et al.Epigenetic inactivation of the candidate tumor suppressor USP44 is a frequent and early event in colorectal neoplasia[J].Epigenetics Official Journal of the Dna Methylation Society，2014，9（8）：1092-1100.
[18]陈志鹏，朱陵君，郭楠楠，等.肿瘤坏死因子-α基因G308A多态性与结直肠癌发病风险Meta分析[J].中华肿瘤防治杂志，2013，20（9）：699-703.
[19] Azimzadeh P，Romani S，Mirtalebi H，et al.Association of co-stimulatory human B-lymphocyte antigen B7-2 （CD86） gene polymorphism with colorectal cancer risk[J].Gastroenterology & Hepatology from Bed to Bench，2013，6（2）：86-91.
[20]王纪全，陈谦，柯娟，等.RASSF1基因SNP与陕西地区结直肠癌发病风险关系的研究[J].现代肿瘤医学，2013，21（7）：1545-1549.
（收稿日期：2016-01-11） （本文编辑：李颖）