蜂胶中五种酚酸对脂质代谢的影响
材料与方法
1.1 材料与试剂
L02正常肝细胞，中国科学院细胞库提供;咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸、亚桂皮乙酸、油红O染料、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、棕榈酸钠（PA），美国Sigma公司提供;胎牛血清（FBS）、青链霉素（10 000 U/L）、非必需氨基酸（NEAA，100×）、0.25%胰蛋白酶，美国Gibico公司提供;牛血清白蛋白（BSA，无脂肪酸），德国Merck公司提供;乙醇（分析纯）、异丙醇（分析纯），北京化学试剂公司提供;苏木精染料、4%的多聚甲醛，北京酷來搏科技有限公司提供;DEME高糖培养基，美国Hyclone公司提供;超纯水纯化系统Milli Q Intergral，美国Merk Millipore公司提供。
1.2 仪器与设备
96孔细胞培养板、10 cm细胞培养皿、细胞冻存管，美国Corning公司产品;0.22 μm微孔过滤膜，德国Merck Millipore公司产品;分析天平，梅特勒-托利仪器有限公司产品;HERA cell 150 CO2型恒温培养箱，美国Thermo Scientific公司产品;Olympus IX71型倒置荧光显微成像系统，日本Olympus公司产品;酶标仪，美国Biotek公司产品;AIRTECH无菌操作台，北京市华威中仪科技有限公司产品。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
细胞培养标准化学品溶液：准确称取咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸和亚桂皮乙酸的标准品，于DMSO中进行溶解，并配成浓度为200 μmol/L的储备液，各储备液经0.22 μm的滤膜过滤后，于-20 ℃条件下储存备用，使用前可按要求浓度进行稀释。
1.3.2 细胞的培养
L02细胞培养于含10%的胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM高糖培养基中。细胞均置于温度37 ℃，CO2 5%，湿度95%的培养箱中，每2 d用胰酶消化传代1次。
1.3.3 MTT试验法检测酚酸对细胞活力影响
MTT试验参照Mosmann文献方法[15]。即在96孔板中，按每孔104个细胞的密度接种处于对数生长期细胞，培养体积为100 μL /孔。接种24 h后，向孔中加入梯度浓度的药物储备液进行培养，DMSO浓度保持为0.1%，空白组为只含0.1%的DMSO，每个浓度做3个复孔。24 h后，弃去培养基上清液，用PBS清洗干净后向其中加入含有MTT（0.5 mg/L）的DMEM完全培养基（含10% FBS），放入37 ℃培養箱中培养。4 h后，弃去培养基上清液，向其中加入150 μL DMSO溶液以溶解多聚甲醛，将96孔板置于摇床上反应10 min，然后于波长490 nm处读取每孔吸光度。存活率即每个浓度的吸光度与空白组的吸光度占比。
1.3.4 细胞脂质累积模型的建立
细胞脂质累积模型参照Xie C等人[16]文献方法构建，稍作调整。简单来说，在12孔板中，按每孔5× 105个细胞的密度在爬片上进行细胞培养，试验组棕榈酸钠（PA）浓度分别为100，200，300，400， 500 μmol/L，空白对照组为只含BSA，共设6个组，每组2个复孔，共同培养24 h后红油染色。方法为培养后迅速吸去12孔板中的培养基上清液，用PBS清洗干净后，向每孔中加入质量分数4%的多聚甲醛溶液400 μL于室温下固定。15 min后将固定液弃掉，用二次水清洗干净后，向每孔中加入500 μL的60%红油O染色液并轻轻摇晃，以使染色液铺染均匀，然后将12孔板于4 ℃条件下染色10 min，期间需避光。染色完成弃掉染色液，用二次水清洗干净后，向每孔中加入苏木精染色液进行染色，保持30 s后弃去，用二次水清洗1 min。最后，将爬片从12孔板中取出，用甘油和载玻片封片，在显微镜下进行观察。每个玻片需选取10个视野，通过Image-Pro Plus软件统计细胞被油红O染色的面积（Sum），用Photoshop软件统计细胞总生长面积（Area），二者数值之比即可反映细胞脂质累积的程度。数据结果以空白对照进行归一化处理。
1.3.5 酚酸对L02细胞脂质累积的作用
在12孔板中，按每孔5×105个细胞的密度在爬片上进行细胞培养，PA处理的模型组（相同浓度BSA+PA+0.1% DMSO），PA与非诺贝特酸处理的阳性对照组（相同浓度BSA+PA+0.1% DMSO+100 μmol/L 非诺贝特酸），PA分别与5，20，50，100 μmol/L 4个浓度的药物处理组（相同浓度BSA+PA+0.1% DMSO +不同浓度的药物储备液），只含BSA的空白对照组（相同浓度BSA+0.1% DMSO），共设置7个组，每组2个复孔。药物处理组培养24h后红油染色，数据结果以空白对照进行归一化处理，分析比较5种酚酸类物质的降脂作用差异。
1.3.6 统计学分析
通过SPSS 19软件对获得的结果数据进行统计学分析，采用t检验进行显著性评价，当p<0.05即认为具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 酚酸对L02细胞活力的影响
不同浓度的咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸、亚桂皮乙酸和棕榈酸对L02细胞活力的影响见图1。
采用MTT法评价了蜂胶中咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸、亚桂皮乙酸5种酚酸类物质对L02人肝细胞细胞活力的影响。由图1可知，5种酚酸类物质在选择的浓度梯度范围内对L02人肝细胞皆不具有明显毒性，甚至咖啡酸在一定浓度范围还能够促进L02人肝细胞的增殖。相较而言，只有阿魏酸浓度在200 μmol/L时，其与空白组相比，细胞存活率的降低具有显著性，但细胞存活率仍在85%以上。
2.2 PA诱导L02细胞产生胞内脂质累积
PA处理24 h后L02人肝细胞细胞内脂质累积情况见图2。
采用MTT法评价了棕榈酸（PA）对L02人肝细胞细胞活力的影响。由图2可知，当PA浓度高于100 μmol/L时，将会对L02人肝细胞细胞活力产生显著性影响;当PA浓度高于300 μmol/L时，L02人肝细胞的存活率低于70%;当PA浓度为500 μmol/L时，L02人肝细胞的存活率仅为54%。此外，通过显微镜对细胞进行观察，可观察到已有一定数量的细胞呈漂浮状态。因此，研究选择的PA作用浓度为不高于500 μmol/L。
PA能够诱导L02人肝细胞内脂滴的形成，并且形成脂滴的单位面积会随着PA作用浓度的增加而呈现增大趋势。当PA作用浓度大于300 μmol/L时，细胞生长面积开始减小，这与MTT试验中细胞存活率的变化趋势相一致。此外，已有研究表明[17]，当PA作用浓度达到300 μmol/L时，即可影响细胞内多个通路蛋白的正常表达，并引发细胞发生脂质代谢异常。因此，试验选择300 μmol/L作为PA的作用浓度，用于接下来的L02人肝细胞相关研究。
2.3 蜂胶中酚酸对L02细胞脂质累积的影响
PA和不同浓度异阿魏酸（IFRA）处理24 h后L02人肝细胞细胞内脂质累积情况见图3。
通过对模型组、阳性对照组、空白组及不同浓度的药物处理组的红油O染色，以及对细胞内脂滴面积进行统计分析，结果显示PA（300 μmol/L）作用24 h后，细胞内脂质累积程度可达空白对照组的1.5～3.0倍，对于药物处理组，试验选择的5种酚酸类物质中异阿魏酸的降低细胞内脂质累积的效果最好，相较于阳性对照组使用的非诺贝特酸，异阿魏酸在浓度同为100 μmol/L时，可将脂质累积降低约22%，同浓度的非诺贝特酸的平均脂质累积减少约为30%。同时，研究结果还表明，另外4种酚酸类物质咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和亚桂皮乙酸并没有令人满意的改善细胞内脂质累积的效果。
3 结论
以中国蜂胶作为研究对象，对中国蜂胶中含量最多的5种酚酸类成分包括咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸和亚桂皮乙酸进行调节脂质代谢效果评价。通过建立L02人肝细胞脂质累积模型，评价筛选出了这5种酚酸类成分中具有较好降低脂质累积效果的有效成分异阿魏酸，并通过试验研究确定其最佳的作用浓度为100 μmol/L。
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