烟草根系分泌物成分的鉴定及其对烟草疫霉菌的影响
摘要 [目的]探究烟草根系分泌物不同成分对烟草疫霉菌的影响。[方法]利用液质联用法鉴定烟草革新3号根系分泌物的成分，采用生长速率法测定烟草根系分泌物的抑菌效应。[结果]相对含量较高的32种烟草根系分泌物中，有12种分泌物对烟草疫霉菌具有抑制作用，5种具有促生作用；在800 μg/mL浓度处理下，酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸和土木香内酯对烟草疫霉菌抑制率分别为92.87%、97.14%、91.33%和93.76%，以水杨酸的抑菌效果最佳，与对照相比，其EC50均小于500 μg/mL，其中酒石酸的毒力最强，EC50为159.68 μg/mL。[结论]酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸和土木香内酯4种根系分泌物对烟草疫霉菌有较好的生防效应。
关键词 烟草；根系分泌物；烟草疫霉菌；生物活性；抑制作用
中图分类号 S435.72；TS411+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0148-05
Abstract [Objective] The aim was to determine the effect of tobacco root exudates on Phytophthora nicotianae.[Method]LCMS，determination of inhibitory effects were used to reveal the inhibiting effects of tobacco Gexin 3 root exudates on Phytophthora nicotianae.[Result]There were 32 compounds with high contents in tobacco root exudates.Among them，12 compounds had the effect on inhibiting；5 compounds had the effect on promoting P.nicotianae；the others had no inhibiting effect.Compared with the control，tartaric acid，salicylic acid，2furoic acid and alantolactone had significant inhibition on the growth of mycelium of P.nicotianae，and their inhibition rates at 800 μg/mL were 92.87%，97.14%，91.33% and 93.76%，respectively.Salicylic acid had the strongest inhibition effect.The EC50 of them were less than 500 μg/mL.Tartaric acid had the strongest toxicity，and its EC50 was 159.68 μg/mL.[Conclusion]Four root exudates can effectively control P.nicotianae.
Key words Tobacco；Root exudates；Phytophthora nicotianae；Biological activity；Inhibition effect
烟草黑胫病是由烟草疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）侵染引起的一种毁灭性土传病害，黑胫病菌的游动孢子形成快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个季节可以发生多次侵染[1]。在我国，烟草黑胫病菌有0号和1号2个生理小种，以0号小种为优势小种[2]。近年来烟草黑胫病在我国发生普遍，严重烟田发病率在45%以上，甚至造成烟田绝收，造成较大的经济损失[3-5]。目前，烟草黑胫病的防治措施仍以药剂防治为主，化学药剂容易导致病原菌产生抗药性、环境污染、残留等问题。因此，在烤烟生产中需要寻求一种天然、环保、有效的途径来控制烟草黑胫病的发生[6-8]。
根系分泌物是在植物生长过程中根系向环境中释放的一系列物质，如有机酸、可溶性蛋白质、可溶性糖、黏胶质、细胞脱落物等[9-10]。根系分泌物影响和调节着根际土壤的物理特性、营养有效性以及植物根系与根际土壤微生物、病原菌及其他生物之间化学信号交流的生物学过程。对于植物缓解外界胁迫、促进养分及与土壤的物质交流等具有重要作用[11]。
烟草革新3号作为选育抗烟草黑胫病高抗品种[12]，在与土壤交流的生物学过程中，向土壤释放不同种类的根系分泌物，研究这些物质潜在的生物学效应，对防治烟草疫霉菌有重要的理论指导意义。鉴于此，笔者筛选了革新3号根系分泌物主成分，并研究了根系分泌物对烟草疫霉菌的抑制效应，旨在筛选出高效、安全的防治材料，为安全有效防治烟草黑胫病提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供試烟草。革新3号（高抗烟草疫霉菌品种）和小黄金1025（高感烟草疫霉菌品种）均由中国农业科学院烟草研究所烟草种质资源库提供。
1.1.2 供试菌株。烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）0号生理小种由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究室分离、纯化。
1.1.3 供试药剂。蓖麻烯、棕榈酸、l-2-氨基-3-甲基正丁酸、丁酰乳酸乙酯购自北京伊诺凯科技有限公司；缬草酸、对庚氧基苯甲酸、油酸、硬脂酸、三丁酸甘油酯、土木香内酯购自上海化学试剂公司；酒石酸、γ-亚麻酸购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氧化聚乙烯、洛柯宁碱、茉莉酮购自北京普益华科技有限公司；环己胺、二硝托胺、2，4-戊二烯-4-内酯购自上海翊圣生物科技有限公司；硫代苯甲酸S-羟甲酯、水杨酸、亚麻酸、2-呋喃甲酸、肉桂酸异戊酯三丙酸甘油酯、海墨菊内酯、松香醇购自北京中冉旭升科技发展有限公司；6-姜酚、2-乙酰基吡咯、甲基黄嘌呤、癸烯二酸、6，7-二羟基香豆素、多巴醌购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.4 主要仪器。仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS： Ultimate 3000 高效液相（美国Thermo公司），Orbitrap Elite质谱仪（美国Thermo公司），分离色谱柱C18色谱柱[Hypergod C18 （100.0 mm×4.6 mm×3 μm），美国Thermo公司]；真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；Milli-Q（18.2i）超纯水处理系统（美国 Millipore 公司）；电子天平。
1.2 方法
1.2.1 根系分泌物的收集。
参照张文明等[13]的方法收集根系分泌物。将4叶期烟苗定植于花盆中后，置于人工气候室连续培养56 d，培养昼夜温度为白天30 ℃、夜晚25 ℃。培养基质为灭菌土壤、草炭和珍珠岩（体积比为2∶2∶1）。取出烟株，将根部泥土清洗干净，置于无菌水中静置24 h，取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过。滤液冷冻干燥后-20 ℃保存。
1.2.2 根系分泌物的LC-MS检测。
1.2.2.1 色譜条件。柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；流动相组成A为水+0.1%甲酸，B为乙腈+0.1%甲酸。进样量为4 μL，自动进样器温度4 ℃。
1.2.2.2 质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI源），同时采用正、负2种离子化模式检测。正模式：离子源温度300 ℃，鞘气45 arb，辅助气15 arb，吹扫气1 arb，喷雾电压为3.0 kV，毛细管温度350 ℃，碰撞诱导解离能量为30%；负模式：离子源温度为300 ℃，鞘气为45 arb，辅助气为15 arb，吹扫气为1 arb，喷雾电压为3.2 kV，毛细管温度为350 ℃，碰撞诱导解离能量为60%。
1.2.2.3 数据处理。应用SIVE软件（Thermo公司）对LC/MS数据进行预处理及归一化，并在Excel 2007软件中进行编辑，将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件（版本13.0）进行主成分分析（PCA）。
1.2.3 根系分泌物对烟草疫霉菌的抑菌活性分析。
将LC-MS检测结果含量较高的根系分泌物溶于燕麦培养基中，采用菌丝生长速率法测定其对烟草疫霉菌抑菌活性[14]。分别配制成浓度为500 μg/mL的含药培养基，再在固体培养基上接菌，28 ℃培养5 d，观察烟草疫霉菌菌丝生长情况。预备试验发现根系分泌物中对烟草疫霉菌菌丝有明显抑制作用的有12种物质。
1.2.4 典型根系分泌物有效抑制浓度的筛选。
将12种根系分泌物分别配制成浓度为1、10、100、800、1 500 μg/mL的溶液，溶液经过除菌过滤器过滤，与燕麦培养基按体积1∶9混合，再在固体培养基上接种，28 ℃培养3 d后测量菌落直径，每次处理重复4次。预备试验发现，12种根系分泌物对烟草疫霉菌菌丝的抑制作用明显的浓度为100～800 μg/mL。
1.2.5 典型根系分泌物的抑菌效应。
将12种根系分泌物配制成浓度为0（CK）、100、400和800 μg/mL的溶液，溶液经过除菌过滤器过滤，与燕麦培养基按体积1∶9混合，再在固体培养基上接种，28 ℃培养7 d后测量菌落直径，每次处理重复4次。采用十字交叉法测量菌落直径，并计算不同处理对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制率。
菌落直径=测量菌落平均值-0.5（菌片直径）
烟草疫霉菌菌丝生长抑制率=（1-处理菌落直径/对照菌落直径）×100%
采用Excel和DPS软件对试验数据进行毒力计算，抑菌率换算成概率值，质量浓度以对数值表示，以各物质不同质量浓度的对数值（x）和菌落生长抑制率的概率值（y）求取毒力回归方程y=a+bx以及相关系数，并计算抑菌中浓度（EC50）。
2 结果与分析
2.1 烟草根系分泌物的成分分析
LC-MS结果（图1）表明，革新3号根系分泌物主要包括烃类、苯、噻唑、酸、酮、酰胺、酯、醇和酚，其中噻唑、酰胺为首次报道的烟草根系分泌物。水溶性有机酸、长链脂肪酸、苯甲酸的衍生物、醇、脂肪簇醛、酮、苯、酚、烃类及其衍生物等低分子有机化合物则是常见的烟草根系分泌物。
2.2 根系分泌物对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制效果
32种根系分泌物对烟草疫霉菌菌丝生长作用结果见表2。在浓度为500 μg/mL时，12种根系分泌物酒石酸、棕榈酸、油酸、水杨酸、亚麻酸、2-呋喃甲酸、茉莉酮、6，7-二羟基香豆素、二硝托胺、丁酰乳酸乙酯、三丁酸甘油酯和土木香内酯对菌丝生长的抑制率均>30%，抑制率依次为91.19%、30.89%、30.77%、88.05%、30.16%、82.19%、44.29%、78.45%、49.18%、45.21%、33.60%和87.09%。5种根系分泌物缬草酸、对庚氧基苯甲酸、三丙酸甘油酯、2-乙酰基吡咯、6-姜酚均促进菌丝生长。其他物质对菌丝生长作用不显著。综上，在烟草根系分泌物中，有抑制烟草疫霉菌菌丝生长的化合物，也有促进菌丝生长的化合物。将12种抑制烟草疫霉菌的根系分泌物作为典型根系分泌物，进一步研究其对菌丝的抑制作用。
2.3 典型根系分泌物对烟草疫霉菌的抑菌效应
由表3可知，与对照相比，12种根系分泌物均显著抑制烟草疫霉菌菌丝生长。从处理浓度对烟草疫霉菌菌丝生长的抑制率效应来看，随着浓度的提高，其抑制效果也越来越明显。在低浓度（100 μg/mL）条件下，酒石酸、6，7-二羟基香豆素和土木香内酯的抑制率分别为33.71%、22.32%和22.31%，以酒石酸的抑菌效果最好。在高浓度（800 μg/mL）的条件下，酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸和土木香内酯的抑制率分别为92.87%、97.14%、91.33%和93.76%，以水杨酸的抑菌效果最好。
2.4 对烟草疫霉菌菌丝生长的毒力分析
由表4可知，12种根系分泌物处理浓度与菌丝生长的抑制率均呈线性关系。EC50值是衡量杀菌剂毒力的指标，值越小表示其毒力越强。酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸、6，7-二羟基香豆素、土木香内酯的EC50值均小于500 μg/mL。其中，酒石酸的毒力最强，EC50值为159.68 μg/mL，表明其对烟草疫霉菌菌丝生长抑制效果最好。
3 结论与讨论
烟草根系分泌物种类复杂，其中一些物质具有生物活性。烟草革新3号根系分泌物主要为烃类、苯、噻唑、酸、酮、酰胺、酯、醇和酚等。利用LC-MS技术明确烟草革新3号根系分泌物的主要组成。其中，酒石酸、棕榈酸、油酸、水杨酸、亚麻酸、2-呋喃甲酸、茉莉酮、6，7-二羟基香豆素、二硝托胺、丁酰乳酸乙酯、三丁酸甘油酯和土木香内酯12种根系分泌物对烟草疫霉菌具有显著的抑制效应，对疫霉菌抑制率在30%以上。在高浓度（800 μg/mL）的条件下，酒石酸、水杨酸、2-呋喃甲酸和土木香内酯的抑制率分別为92.87%、97.14%、91.33%和93.76%，以水杨酸的抑菌效果最好。EC50的使用浓度分别为159.68、257.02、227.03、202.28 μg/mL，均小于500 μg/mL。这说明烟草根系分泌物中的一些物质在防治土壤病害方面的效果良好，其原因可能与该类物质对烟草疫霉菌具有较强的熏蒸和杀生作用有关[15]。
在自然环境中，根系分泌物中的不同物质产生累加效应，其抑菌作用由综合效应加以确定[16-17]。根系分泌物抑菌试验表明，根系分泌物中少数化合物对土传病害病原菌繁殖或孢子萌发有明显的抑制作用[18]，其生物活性也随着化学结构的不同而存在差异；而有些化合物对病原菌的繁殖和孢子萌发有促进作用，这与根系分泌物中氨基酸、多糖、脂类等成分为土传病原菌提供生存所必需的碳源和氮源有密切关系[19]。该研究结果对筛选抗病品种与控制烟草疫霉菌病害的发生具有重要意义。
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