大鼠心脏能量代谢底物随年龄增长的变化及调节

材料与方法

1.1 实验动物 健康、雄性、清洁级SD大鼠月龄2、14个月，各8只，体质量分别为270～350 g、600～800 g。大鼠分笼饲养，控制室温为20～24 ℃、湿度为50%～60%、动物房光暗周期为12 h/12 h，饮用水及标准“大小鼠维持饲料”均经灭菌后动物自由摄取。两组大鼠分为老龄组和青年组：Aging & Control（AC）组8只，Young & Control（YC）组8只。

1.2 药品与试剂 BCA法测定蛋白浓度，试剂盒由武汉博士德生物科技有限公司生产。ATP标准品钠盐由美国Sigma公司购入。GLUT-4抗体由英国abcam公司购入，肉碱脂酰转移酶-1（CPT-1）抗体由北京博奥森生物科技有限公司购入，GAPDH抗体由杭州贤至生物科技有限公司购入，二抗：采用已被碱性磷酸酶作为标记的羊抗兔抗体，由北京中杉金桥生物科技有限公司购入。

1.3 超声心动图 灌胃4周末，常规3%的戊巴比妥麻醉，大鼠仰卧位。于左室长轴切面测定收缩末和舒张末室间隔的厚度（IVSs、IVSd）和收缩末和舒张末左心室的内径（LVIDs、LVIDd），以及收缩末和舒张末左心室后壁的厚度（LVPWs、LVPWd），计算出收缩末和舒张末左室容量（LVESV、LVEDV）、左室射血分数（EF）、左室短轴收缩分数（FS）[5]。

1.4 血液采集 于腹主动脉采血2～3 mL，以3000 r/min的速率，离心10 min，将血清标记之后冻存于-80 ℃冰箱备用。检测血脂（TG）、血糖（Glu）、胆固醇（TC、LDL-C、HDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）以及乳酸脱氢酶（LDH）的含量均应用分光光度仪测量。

1.5 HPLC测定心尖组织ATP含量 把离体的心脏置于4 ℃预冷的生理盐水中，切取心尖部的心肌组织（大约300 mg），迅速放入液氮中，随后转移至-80 ℃超低温冰箱冻存。HPLC系统采用ODS HYPERSIL C18色谱分析柱（规格型号：250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为室温（<25 ℃）；采用50 mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH 6.5）作为流动相，流速设置为1 mL/min；紫外线检测波长254 nm；样品进样体积20 μL；以标准曲线法计算ATP含量[6-7]。根据被测心肌的质量和所含ATP量进一步推算出每1 g心肌组织含有ATP的质量。

1.6 Western blot检测心肌GLUT-4和CPT-1表达情况 取30～40 mg心肌组织，常规提取心肌组织，BCA法测定蛋白质浓度，99 ℃水浴变性10 min，10%的SDS-PAGE凝胶，电泳分离，转印硝酸纤维素膜上，室温（25 ℃）条件下封闭1.5 h，加入一抗（GLUT-4浓度为1∶250，CPT-1浓度为1∶1000，GAPDH浓度为1∶800）4 ℃条件下孵育过夜，用TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（碱性磷酸酶标记，羊抗兔，浓度为1∶4000）室温孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，采用EBCL进行化学发光显色。以GAPDH作为内参蛋白，利用Image-J图像分析软件进行相对灰度值分析。

1.7 统计学处理 统计学分析均采用SPSS 17.0，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组超声心动图指标比较 两组大鼠左心室射血分数均大致正常，AC组较YC组左心室射血分数略下降，但差异均无统计学意义（P>0.05）；两组大鼠左室短轴缩短率、室间隔厚度、左心室舒张末期内径、E/A比值比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 两组大鼠心尖组织ATP含量比较 AC组大鼠左心室ATP含量为（16.80±1.60）ng/g，明显低于YC组的（69.60±1.08）ng/g，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 Western blot检测心肌组织GLUT-4和CPT-1的表达 AC组大鼠心肌GLUT-4与CPT-1表达量分别为0.45±0.23、0.40±0.36，均低于YC组的0.61±0.30、0.60±0.35，AC组大鼠GLUT-4/CPT-1比值为1.12±0.56，高于YC组的1.02±0.48，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.4 两组大鼠相关血清学指标比较 YC组大鼠血清ALP水平显著高于AC组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组大鼠的血清TG、Glu、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、Cr、BUN以及LD比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

3 讨论

与人体其他器官不同，心脏依靠高耗能来维持它的高动力状态。正常心脏每天产生约4 kg ATP等高能磷酸化合物，每天泵出血液约8000 L。心肌能量代谢一般分为三个阶段：在心肌细胞浆内进行的底物利用环节，在线粒体内进行的氧化磷酸化环节，在细胞浆内进行的高能磷酸化合物的转运和利用环节。心脏产生的ATP约70%由脂肪酸有氧氧化产生，30%由葡萄糖有氧氧化产生，也有非常少量的ATP由乳酸、酮体生成。在饥饿、饱餐、运动、应激等反应中，上述代谢底物的组成会发生相应的变化。研究显示在心肌缺血、心肌肥厚、心力衰竭以及衰老等病理、生理情况下，心肌能量的代谢在各个环节均发生了不同改变以维持心脏高能磷酸化合物的生成，而在底物利用环节，最主要的表现是能量代谢底物组成的比率发生了变化，即脂肪酸和葡萄糖氧化的比率發生了变化[4]。

衰老是正常的生理变化，但也是心脏病的独立危险因素，尤其是心功能减退和各种心脏退行性疾病，发病率随着年龄的增加而明显增加，这种相关性独立于动脉粥样硬化和高血压等心脏疾病之外[8-12]。而衰老引起的心脏结构和功能改变，与衰老心脏的能量代谢紊乱有密切的关系。而这种代谢紊乱表现在代谢底物的改变、线粒体功能减退、高能磷酸化合物合成障碍。本研究也证实在衰老心脏发生了底物利用的改变。

有多种脂肪酸参与心肌细胞的氧化过程，其中人类心肌细胞最常见的是十八烯酸（oleic acid），脂肪酸的摄取是一个主动的过程，长链脂肪酸先转化为脂酰辅酶A，在肉碱脂酰转移酶-1（CPT-1）作用下进入线粒体进行脂肪酸的β氧化，这一过程是脂肪酸氧化的关键限速步骤，CPT-1也是脂肪酸氧化的关键酶[4]。因此，检测CPT-1的表达量可以准确的反映脂肪酸的氧化利用情况。

葡萄糖几乎可用于全身的能量合成，心肌细胞葡萄糖的摄取依赖于血液直接摄取，也可以由细胞内的糖原转化而来。葡萄糖的有氧氧化因为高效率、高弹性在心肌能量供应中占有非常重要的地位。心肌细胞摄取葡萄糖依靠细胞膜上的葡萄糖转运蛋白1（GLUT-1）和葡萄糖转运蛋白4（GLUT-4）[13-16]，葡萄糖转运蛋白是葡萄糖氧化的关键限速酶。葡萄糖的转运速度依赖于葡萄糖转运蛋白的表达量，在心肌缺血、饱餐、运动等生理及病理情况下，葡萄糖转运蛋白的表达量会明显增加。本研究选择心肌细胞GLUT-4的表达量来反映葡萄糖的氧化利用情况。

文献[17-20]研究显示，在老龄化的心脏，能量代谢存在着“胚胎型再演”的现象，整体氧化代谢能力减低，生成的总ATP减少。本研究结果也证实：YC组大鼠GLUT-4/CPT-1比值接近1，显示在年轻的大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸的氧化利用率基本相当，而AC组大鼠心脏两者比值较YC组升高（P<0.05），说明随着年龄的增长，大鼠心肌能量代谢底物逐渐转向依赖葡萄糖代谢为主；AC组GLUT-4和CPT-1表达量均较YC组有所下降（P<0.05），说明随着年龄的增长，大鼠心脏利用葡萄糖及脂肪酸的能力均有所下降，其整体氧化代谢能力减低；本实验检测AC组大鼠心肌ATP含量明显降低，甚至出现心脏收缩/舒张功能减退的趋势。

随着大鼠老龄化，心脏整体氧化能力降低，心肌葡萄糖代谢和脂肪酸代谢下降，心脏代谢底物转化为以葡萄糖为主，心脏ATP浓度下降，甚至出现大鼠心脏收缩/舒张功能减退。

参考文献

[1] Sung M M，Dyck J R.Energy Metabolism in the aging heart[J].Heart & Metabolism，2011，52：3-7.

[2] Lopaschuk G D，Belke D D，Gamble J，et al.Regulation of fatty acid oxidation in the mammalian heart in health and disease[J].Biochimica Et Biophysica Acta，1994，1213（3）：263-276.

[3] Koonen D P，Febbraio M，Bonnet S，et al.CD36 expression contributes to age-induced cardiomyopathy in mice[J].Circulation，2007，116：2139-2147.

[4]殷仁富，陈金明.心脏能量学：代谢与治疗[M].上海：第二军医大学出版社，2002.

[5]刘聪聪.左西孟旦和尼可地尔治疗心力衰竭的疗效及其作用机制评价[D].济南：济南大学，2013.

[6]张玲，潘杰.高效液相色谱法测定小鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP的含量[J].中国医院药学杂志，2008，28（21）：1888-1890.

[7]缪宇，王承龙，殷惠军，等.高效液相色谱测定大鼠心肌组织腺苷酸含量[J].北京大学学报（医学版），2005，37（2）：201-202.

[8]姜国良，于晓，徐恺，等.腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析[J].中国老年学杂志，2013，33（5）：1101-1103.

[9] Kates A M，Herreo P，Dence C，et al.Impact of aging on substrate metabolism by the human heart[J].J Am Coll Cardiol，2003，41（2）：293-299.

[10]朱庆磊，杨契，薛桥，等.人工致衰老和自然衰老小鼠抗氧化能力改变的对比研究[J].中国老年学杂志，2003，23（7）：448-450

[11] Desler C，Hansen T L，Frederiksen J B，et al.Is There a Link between Mitochondrial Reserve Respiratory Capacity and Aging[J].J Aging Res，2012，2012：192 503.

[12] Tocchi A，Quarles E K，Basisty N，et al.Mitochondrial dysfunction in cardiac aging[J].Biochim Biophys Acta，2015，1847（11）：1424-1433.

[13] Kolwicz S C，Purohit S，Tian R.Cardiac Metabolism and its Interactions With Contraction， Growth， and Survival of Cardiomyocytes[J].Circulation Research，2013，113（5）：603-616.

[14]關付，于波.心肌细胞葡萄糖转运机制的研究进展[J].心血管病学进展，2005，26（4）：338-342.

[15] Soraya H，Masoud W G，Gandhi M，et al.Myocardial mechanical dysfunction following endotoxemia：role of changes in energy substrate metabolism[J].Basic Res Cardiol，2016，111（2）：24.

[16]李为民，刘怡希.心脏能量代谢重构研究进展[J].中国医学前沿杂志，2013，5（4）：8-11.

[17]于成瑶，王硕仁，赵明镜，等.自然衰老生理性心气虚大鼠心脏能量代谢酶学的物质基础研究[J].山东中医药大学学报，2008，30（4）：337-338.

[18]孙忠实.衰竭心脏能量代谢药物治疗新策略-兼评磷酸肌酸二钠的临床应用[J].中国医院用药评价与分析，2016，16（1）：6-9.

[19]王文艳，钟萍，谢红军，等.正电子发射断层显像评价衰老心肌葡萄糖代谢的变化[J].中华老年心脑血管病杂志，2010，12（4）：292-294.

[20]张会珍，邢艳秋，肖冬，等.磷酸肌酸联合缺血后适应对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2012，28（11）：1611-1614.

（收稿日期：2017-10-12） （本文编辑：张爽）

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