姜黄素在小鼠肝泡状棘球蚴中对TNF—α和TNF—β的影响
对照组、空白对照组。除空白对照组外，其余各组小鼠均采用20%乌拉坦腹腔注射麻醉后，切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺对肝脏注射0.1mlE.m组织混悬液，制备小鼠肝泡状棘球蚴模型，空白对照组注射等量的生理盐水。接种60d后再灌胃饲养60d，然后提取各组小鼠血清采用酶联免疫吸附试验检测各组小鼠血清中TNF-α和TNF-β的含量。结果 感染了E.m的小鼠血清中TNF-α、TNF-β的表达量明显高于空白组（P<0.05）；用药组TNF-α和TNF-β的表达量明显低于模型组（P<0.05）；姜黄素组、阿苯达唑组和联合用药组TNF-α和TNF-β的表达量无统计学差异性（P>0.05）。结论 姜黄素可以使肝泡状棘球蚴模型小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表达量降低。
关键词：姜黄素；泡状棘球蚴；TNF-α；TNF-β
泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcus，AE）是由多房棘球蚴绦虫（Echinococcus multilocularis，E.m）幼虫引起的一种致死性人兽共患寄生虫病。不经治疗者10年致死率可达93%以上[1]。患者术后复发率高[2]，药物治疗是目前最主要的治疗手段。大量研究表明，姜黄素（Curcumin）具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤和抗多种寄生虫病等作用，且价格低廉、副作用小。课题组前期研究发现，泡状棘球蚴的浸润性生长和转移与肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）等炎性因子密切相关。本研究假设Cur对E.m有治疗作用，建立肝泡状棘球蚴小鼠模型，通过灌药的方式进行干预，检测TNF-α和TNF-β在小鼠血清中的表达，初步探讨姜黄素在小鼠肝泡状棘球蚴生长发育过程中对TNF-α和TNF-β的影响。
1 资料与方法
1.1一般资料
1.1.1种鼠和实验动物 24w龄灰仓鼠（泡球蚴腹腔保种16w）2只，体重分别为56g、59g；18w龄健康雌性昆明小鼠132只，体重（25+5）g，均购于新疆自治区疾病控制中心。
1.1.2主要试剂和仪器 姜黄素和姜黄素溶剂（羧甲基纤维素钠）均购于美国Sigma-Aldrich公司，阿苯达唑采用临床治疗所用阿苯达唑药剂，小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠TNF-βELISA试剂盒均购于美国USCN公司，xMark酶标仪（美国BIO-RAD公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将132只18w龄[3]健康雌性昆明小鼠随机分为姜黄素组、姜黄素溶剂注射组、阿苯达唑组、姜黄素+阿苯达唑联合用药组、模型对照组、空白对照组。除空白对照组外其余各组小鼠每只均接种0.1mlE.m混悬液。
1.2.2 动物模型的建立 对种鼠行颈椎脱臼快速处死并固定于操作台，无菌条件下常规开腹，选取腹腔中光滑、游离、透亮、成簇的泡球蚴组织，充分剔除宿主的系膜及纤维组织后，用含双抗（100U/ml青霉素和链霉素）的无菌PBS液漂洗3次，剪碎、研磨、80目钢筛过筛，再用无菌PBS液（含双抗）冲洗，静止5分钟，抽吸上清液和部分浑浊液，重复3次，彻底剔除宿主细胞及坏死组织，加青霉素和链霉素250IU/ml，配 成 浓 度20%的混悬液，0.5%伊红染色后高倍镜下观察泡状棘球蚴原头节活性。活性头节，1-3/高倍镜视野，结构清晰，着色率<15%。20%乌拉坦麻醉（4ml/kg）后采用切开上腹部经腹壁肌层透视下肝穿刺接种[4]，每只注射0.1mlE.m混悬液。
1.2.3 各组小鼠的灌胃 空白对照组和模型对照组小鼠不进行灌胃，姜黄素组每只小鼠7.5mg/d，姜黄素溶剂组（0.5%纤维素钠溶液）每只小鼠0.2ml/d，阿苯达唑组每只小鼠1.25mg/d，姜黄素+阿苯达唑联合用药组每只小鼠1.25mg阿苯达唑+1.25mg姜黄素/d，接种E.m60d后持续灌胃60d，最后一次灌胃于处死小鼠4h前进行。
1.2.4 小鼠血清的采取 对各组小鼠行摘眼球取血，置于生化管中后3000r/min离心25min，取上清液即血清-20°C冻存备用。
1.2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） 采用ELISA试剂盒对各组小鼠血清样本进行TNF-α、TNF-β检测，通过酶标仪读取吸光度（OD）值，并最终计算出浓度。
1.2.6 统计学分析 实验结果以率和（x±s）表示，多组之间感染率的比较采用x2检验；各组Elisa结果用（x±s）描述，采用方差分析；按α=0.05为水准，以P<0.05为统计学有显著差异性。采用SPSS17.0软件分析处理。
2 结果
2.1 造模情况 各组小鼠感染率（肝脏成功感染E.m小鼠数量/每组小鼠数量）无统计学差异性（P>0.05），饲养过程中死亡的小鼠解剖后观察是否成功感染E.m，肝脏上有泡球蚴组织的小鼠同样计入成功感染小鼠；最终各组存活小鼠数量，见表1。
2.2 大体观察 肝泡状棘球蚴组可见包虫组织呈多发的、大小不等的簇拥成结节状，团块状的小囊泡，表面凹凸不平，大部分囊泡透亮，少部分略带浑浊，与正常肝脏组织分界不清（见图1）。
2.3 血清中TNF-α和TNF-β浓度检测结果 见表2。
3讨论
泡状棘球蚴感染宿主之后，原头节的增殖会导致病灶逐渐扩大，严重侵害肝脏，并可使肝脏发生纤维化。同时还可通过浸润扩散、血行播散、淋巴转移和种植转移的方式，发生似恶性肿瘤样转移，侵袭肺、脾脏等器官。目前临床用药多为单一的苯并咪唑类药物为主，但毒副作用大，因此有效的副作用小的抗包虫药物的研究是目前主要的研究方向之一。
有研究表明，在泡球蚴感染中，囊泡周围的肉芽肿和外周血中均可检测到TNF-α的表达。本课题组前期研究结果显示：泡球蚴感染宿主后，可引起TNF-α蛋白高表达，而TNF-α参与了诱导泡球蚴周围宿主单核细胞的凋亡，从而抑制宿主的免疫功能，以达到在宿主体内生长、发育的目的[5]。TNF-β虽然与TNF-α来源于不同细胞，但它们有30%左右的同源性[6]，作用于共同受体TNFR，广泛参与免疫系统的发育、免疫调节和炎症反应，可以促纤维细胞生长和促胶原分泌，从而参与机体的纤维化进程[7]。本研究结果显示，TNF-β在各组小鼠血清中的表达趋势与TNF-α大致相同，感染了E.m的小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表达明显高于空白组（P<0.05）；用药组小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表达明显低于模型组（P<0.05）。
本研究显示姜黄素可降低肝泡状棘球蚴模型小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表达，且姜黄素组与阿苯达唑组和联合用药组TNF-α和TNF-β表达无没明显差异（P>0.05）。杨维泓等[8]发现姜黄素可以抑制小鼠肿瘤血管内皮细胞生长的作用。Jon等[9]发现姜黄素可以将人乳腺癌细胞阻断于M期，从而抑制其增殖。Duvoix等[10]报道姜黄素还能阻断TNF-a的表达，抑制谷胱甘肽转移酶的mRNA表达来诱导K562白血病细胞的凋亡。此外，Allam等[11]报道，姜黄素可以调节曼氏血吸虫宿主血中的IL-12和TNF-α，促进嗜酸性粒细胞的生成，有效的抑制曼氏血吸虫在宿主体内的生长发育，同时可以减轻宿主肝纤维化的程度。由此我们推断，姜黄素可能通过①抑制泡球蚴血管生成；②诱导细胞周期阻滞；③调节凋亡抑制基因的表达；④减轻宿主肝纤维化程度；⑤调节宿主体内炎性因子的表达等方式作用于泡状棘球蚴。
综上所述，姜黄素可以降低肝泡状棘球蚴模型小鼠血清中TNF-α和TNF-β的表达，且具有分子量小、亲脂性强，体内易被肠道和肝脏迅速代谢，毒副作用小等特点。但姜黄素在泡状棘球蚴小鼠模型中的具体作用机制，以及是否可以用作临床抗包虫药物还有待于进一步研究。
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编辑/苏明哲
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