基于代谢组学的不同姜汁制黄连药性的比较研究

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[摘要]运用UPLCTOFMS高分辨质谱联用技术，通过给大鼠灌服生黄连、鲜姜汁制黄连、干姜汁制黄连、鲜姜汁和干姜汁，收集不同时间点各组大鼠的尿液，对大鼠尿液进行代谢组学分析，探讨生姜榨汁和干姜煮汁2种不同姜汁辅料炮制对黄连药性的影响。采用PeakviewTM 1.7 软件对正离子模式总离子流图进行处理，并结合 MarkerviewTM 20 软件进行主成分分析（PCA），根据Scifinder，Chemspider等相关数据库的检索结果并结合相关文献报道，筛选潜在生物标记物并描绘其含量变化。结果显示，黄连经不同药性姜汁辅料炮制后对其能量代谢产生不同影响。确定了9个与药性相关的生物标记物，分别为肌氨酸、马尿酸、肌酐、犬尿氨酸、酪氨酸、L色氨酸、烟酸、花生四烯酸和L脯氨酸，其中，参与色氨酸代谢路径的有L色氨酸、犬尿氨酸、烟酸；参与精氨酸、脯氨酸代谢路径的有肌氨酸、肌酐、L脯氨酸、酪氨酸；以及炎性介质白细胞三烯B4的前体物质花生四烯酸；在大鼠尿液中的含量从高至低依次为干姜制黄连组、鲜姜制黄连组和生黄连组，各标记物在干姜汁组中含量均高于鲜姜汁组。可见生黄连、干姜汁制黄连、鲜姜汁制黄连寒性由强渐弱，其药性差异对药物抗炎作用也产生不同影响；不同辅料姜汁的药性研究结果与干姜汁性热、鲜姜汁性温的结论相吻合。该研究结果将为今后不同姜汁作为炮制辅料的适宜应用提供科学依据。

[关键词]代谢组学； 不同姜汁； 制黄连； 药性

黄连为寒性中药，经姜汁炮制后，寒性得到缓和，其药理药效发生一定的改变。这些改变往往和机体用药前后的新陈代谢变化密不可分，因此，姜汁炮制后黄连药性、药理和药效作用的改变可以通过代谢产物的变化规律得以体现。

姜汁的制备方法始见于汉代张仲景的《金匮玉函经》：“生姜一斛出汁三合半。皆薄切之，乃捣绞取汁，无生者用干者，一两当二两。”[1] 这里的姜汁并非作为炮制辅料应用， 而只是作为单味药汁。生姜汁作为炮制辅料始见于《刘涓子鬼遗方》，曰“半夏：汤洗七遍，生姜浸一宿，熬过。”在我国最早炮制专著《雷公炮炙论》中有记述，后世增加的有姜自然汁拌蒸、姜汁炙的炮制方法，在清代及以前的中药经姜制者多达90 多种，且以生姜捣取自然汁应用为主。姜制法在宋代发展最快，明代、清代稍次，宋代为姜制法的形成奠定了基础[2]。姜汁作为炮制辅料，其炮制目的有引药归经、协同增效、减毒等，但姜汁的确切制备方法和用量等未见专门记载，一般多在姜制饮片制法中提及，其中除了以生姜捣取自然汁和生姜煮汁外，也包括干姜煮汁等。

生姜和干姜从入药历史开始，即经历了由混用不分到分功效临床应用的漫长过程。中医理论认为生姜性辛温，干姜性辛热，存在明显差异，现代研究也发现，生姜在制备干姜过程中，会使成分发生较大变化，从而导致药效和临床功效的不同。历史上对于生姜和干姜，无论是在来源、成分、药效、药性还是临床配伍中，都有对其差异性的考证研究，但对这种差异性的认识，在炮制药物过程中并未得到充分重视，干姜汁或生姜汁均统一作为辅料姜汁炮制药物，制约了药物在临床的更准确应用。

姜制黄连是黄连的主要炮制品种之一，不同姜汁辅料炮制黄连可能会对其药性产生不同影响，从而影响其临床应用。本实验运用UPLCTOFMS高分辨质谱联用技术，通过给大鼠灌服生黄连、鲜姜汁制黄连、干姜汁制黄连、鲜姜汁和干姜汁，收集不同时间点各组大鼠的尿液，对大鼠尿液进行代谢组学分析，以此探讨不同姜汁制黄连对其产生的影响差异，阐明不同姜汁在药物炮制中的作用差异，为姜汁作为炮制辅料的临床合理应用奠定基础。

1材料

UPLCTOFMS联用：液相为岛津UPLC色谱仪（日本岛津公司），质谱为MSTOF质谱仪（美国AB公司，型号5.600），台式低温高速冷冻离心机（Sartorius，Germany）。

乙腈（HPLC级，DIMA TECHNOLOGY INC，USA）；甲醇（HPLC级，DIMA TECHNOLOGY INC，USA）；甲酸（Sigmaaldrich，USA）；超纯水（娃哈哈集团有限公司）。

黄连购于江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，产地为四川，经江西中医药大学葛菲教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch的干燥根茎。鲜姜购于市场，干姜购于药店，经江西中医药大学葛菲教授鉴定为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的干燥根茎。

选用SD系雄性大鼠，SPF级，体重1.80～2.20 g，共4.8只，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）201.30004。

2方法

2.1样品制备

鲜姜汁：洁净其表面的泥土，切成小碎块，榨汁，即得鲜姜汁（1∶1）。干姜汁：切成相似大小的小块，煎煮2次，合并煎液，浓缩即得干姜汁（1∶1）。生黄连：取黄连原药材，除去杂质，抢水洗净，润透，切薄片，干燥，筛去碎屑。鲜姜汁/干姜汁黄连： 取黄连片100 g，分成2等份，分别加入鲜姜汁、干姜汁各10，3.3 g拌匀，稍闷润后，待鲜、干姜汁吸尽后，于炒锅中，保证药面温度在1.20 ℃左右，翻炒1.5 min，取出晒凉，除去碎屑。将生黄连及鲜、干姜汁黄连置粉碎机中粉碎，然后过50目筛，即得。

2.2分组及给药

SD大鼠随机分为6组：生黄连组、鲜姜汁黄连组、干姜制黄连组、鲜姜汁组、干姜汁组、空白组，每组8只动物。大鼠适应环境3 d后，再置于代谢笼中适应3 d，于第4天开始，取100%生黄连、干姜汁制黄连、鲜姜汁制黄连、干姜汁、鲜姜汁水煎液进行灌胃，空白组给予相同量的生理盐水，每次给药3 mL（约含生药3 g），1次/d，连续给药2.9 d，给药期间常规自由喂养，给水。

2.3大鼠尿样采集与处理

在给药期间分别收集5个时间点大鼠的尿液，分别在给药的第1，8，1.5，2.2，2.9天，每次给药后2 h开始采集，约收集3～4 h大鼠尿液。收集的尿液先过02.2 μm的微孔滤膜，取1 mL于4 ℃以1.3 000 r·min-1高速离心5 min，取上清液05 mL，加1倍体积的甲醇离心去蛋白，再用02.2 μm滤膜滤过，置于-4 ℃冰箱，备用。

2.4HPLCMS/MS采集数据

2.4.1色谱条件Ultimate XBC1.8 UHPLC色谱柱（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm）；流动相乙腈（A）01%甲酸（B），流速04 mL·min-1；进样量5 μL；柱温3.5 ℃。B相比例随时间变化：0～2 min，10%～2.5%；2～6 min，2.5%～60%；6～8 min，60%～70%；8～1.2 min，70%～90%；1.2～1.4 min，90%；1.401～20 min，90%～10%；20～2.5 min，10%。

2.4.2质谱条件电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测，源喷雾电压（IS） 4 500 V，辅助加热气温度600 ℃，雾化气 50 psi（1 psi=6895 kPa），辅助气 50 psi，气帘气 50 psi； 解簇电压80 V；采集方法 TOFMS/MS，准确质量数用自动校正系统（CDS）进行校正。扫描方式为全扫描，质谱扫描范围为m/z 90000 0～1 000000 0。

2.4.3数据分析采用PeakviewTM 1.7 软件对正离子模式总离子流图进行处理，并结合 MarkerviewTM 20 软件对正离子模式下的质谱峰进行自动峰匹配，峰对齐和归一化处理。主要参数设置为质谱的质量误差：01；噪音消除水平：100；初始和结束保留时间分别为0，20 min；统计相对分子质量范围90～1 000。主成分分析模式（PCA）分析化合物之间的差异，输出得分（score）图和因子载荷图（Loading），对数据分组并得到差异性标志物。

根据Scifinder，Chemspider等相关数据库的检索结果并结合相关文献报道，对差异性成分的分子离子峰进行识别、校正，根据各化合物的保留时间、相对分子质量及在质谱中的裂解后的碎片离子，鉴定出所得黄连姜制前后体内代谢差异性标志物信息，误差均小于5。

3结果

3.1各组大鼠不同时间点的PCA时间轨迹

不同组别在不同时间点，数值的距离和聚集程度不同，而该数值距离的差异性能够反映黄连经不同姜汁辅料炮制后，其生品、炮制品及辅料的水煎液在不同时间点对大鼠尿液中内源性物质的代谢产生不同的影响。分析的结果表明：给药后，生黄连组、干姜黄连组、鲜姜黄连组、鲜姜汁组、干姜汁组完全分离开，同组之间聚集紧密，不同组之间呈现差异性，见图1。

同时，不同给药组的大鼠尿液随给药时间的变化逐渐产生变化，各组大鼠尿液样品代谢物同组间出现距离差异，第1天取样与第2.9天取样在5组给药组中均出现明显差异，同组间聚集程度和距离较近，不同给药组数值距离及聚集程度增大，且时间间隔越大，差异性越大，其差异性随时间变化呈现一定的趋势。

结果提示黄连经不同姜汁制后，内源性生物标记物存在差异性变化，聚集程度的差异性反应了药性的寒热差异。

3.2可能存在的内源性生物标记物

通过有目标筛查和无目标筛查2种方法相结合，标记物的鉴定采用正离子一级，二级高分辨质谱信息，并结合各数据库网站（http：///，http：//www.massbank.jp/en/database.html/，http：//www.lipidmaps.org等）检索，得出可能生物标记物其化合物名称与参与的生理生化功能，结果见表1。

3.3可能存在部分生物标记物的二级图谱

采集的总离子流图见图2，通过有目标筛查和无目标筛查2种方法相结合，以数据处理软件PeakviewTM提取得到9种生物标记物的一级与二级质谱谱，见图3。这9种标志物多为氨基酸类化合物，一级母离子均以[M+H]+为基峰。脱去-COOH与脱去-NH₂是该类化合物常见二级碎片。本实验以马尿酸，L酪氨酸，烟酸，花生四烯酸为例，详细分析化合物的裂解过程。全部化合物的碎片信息详见表1。

马尿酸：保留时间为4.1.9 min，一级质谱的精确

A给药第1天； B给药第2.9天；绿色为生黄连组；蓝色为鲜姜黄连组；红色为干姜黄连组；黄色为空白组；黑色点为鲜姜汁组；紫色为干姜汁组（图2同）。

质核比为m/z 1.80065 5 [M+H]+，通过计算分子式为C9H9NO₃，初步鉴别该化合物可能为马尿酸。其在碰撞能量下产生质核比为m/z 1.2.1064 2，10503.3 2等碎片离子，进一步确认该化合物结构。其中m/z 1.2.1064 2 [M-COOH-CH₂+H]+为马尿酸脱羧基，脱亚甲基后产生的碎片，m/z 10503.3 2为[M-COOH-CH₂-NH₂+H]+为马尿酸脱羧，脱亚甲基，再脱去氨基后生成。

L酪氨酸：保留时间305 min，一级质谱的精确质核比为m/z 1.82081 1 [M+H]+，通过计算分子式为C9H1.1NO₃。其在碰撞能量下产生质核比为m/z 1.3.605.8 3，107030 8等碎片离子，推测该化合物为酪氨酸。其中m/z 1.3.605.8 3 [M-COOH+H]+为酪氨酸脱去1分子羧基产生，m/z 107030 8为其继续脱去1分子氨基产生的碎片离子。根据母离子信息并结合特征碎片离子，同时考虑到体内氨基酸绝大多数为L构型，因此，推断该化合物为L酪氨酸。

烟酸：保留时间1.4.4 min，一级质谱的精确质核比为m/z 1.2.403.8 9 [M+H]+，通过计算分子式为C6H5NO₂。其在碰撞能量下产生质核比为m/z 10602.8 1碎片离子，为母离子脱去1分子水产生。根据母离子信息并结合特征碎片离子，推测该化合物为烟酸。

花生四烯酸：保留时间1.701 min，一级质谱的精确质核比为m/z 305.2.4.4 2 [M+H]+，通过计算分子式为C₂0H₃2O₂，初步鉴别该化合物可能为花生

A肌氨酸；B马尿酸；C肌酐；D犬尿氨酸；EL酪氨酸；FL色氨酸；G烟酸；H花生四烯酸；IL脯氨酸（图4同）。

四烯酸。其在碰撞能量下产生质核比为m/z 2.5.9203 8碎片离子，为母离子脱去1分子羧基产生。

3.4可能标记物的相对含量比较

研究发现，可能存在的生物标记物在不同给药组中其含量不同，以空白组为基准，经代谢组学软件MarkerviewTM处理，得出各组部分可能存在的生物标记物含量的倍性变化，见图4。

结果显示，各可能标记物含量，均表现为干姜汁

1生黄连组；2干姜汁制黄连组；3鲜姜汁制黄连组；4鲜姜汁组；5干姜汁组；纵坐标为炮制组与空白组的标志物峰面积比率。

制黄连组大于鲜姜汁制黄连组，并都高于生黄连组；干姜汁组高于鲜姜汁组。

4讨论

中药的四性五味是中药的基本属性，但寒性中药在中医临床应用中对人体有一定副作用，经温、热性辅料炮制后，其药性药效得以改变，既扩大了用药范围，又减低了寒性中药的偏性，但目前对炮制影响药物寒热药性的作用机制阐述尚不明确。

代谢组学作为后基因组时代的一种全新的组学技术，它从整体观出发，通过考察由病理生理刺激或遗传修饰引起的生物体内源性低相对分子质量代谢产物的动态规律变化或其随时间的变化，来研究整体的生物学状况[3]。刘树明等[4]运用代谢组学和主成分分析法，通过研究苦寒性中药黄连和温热药中药高良姜比较对热病症候的干预症候模型，对中药药性与药效的相关性进行探讨，研究结果表明，代谢组学可应用于中药的干预作用研究，也可对中药寒热药性进行表征。

本实验采用代谢组学手段，用温、热性辅料鲜姜汁和干姜汁对寒性中药黄连进行炮制，并对黄连经不同姜汁炮制后给药，以及不同姜汁给药组进行研究，结果发现，在不同姜汁制黄连中，主要的可能标记物有烟酸，马尿酸，犬尿氨酸，L色氨酸，花生四烯酸，L脯氨酸，肌酐，肌氨酸，酪氨酸，并且它们的含量在不同组别中表现出差异性。

色氨酸作为机体必须氨基酸之一，是蛋白质生物合成中的基础，且生物体自身不能合成，需从食物中摄取以满足自身的需要，在维持氮平衡肌肉质量和体重等方面具有重要的作用，它参与多条代谢通路，是神经递质5HT合成的前体[56]。研究发现[7]，温热药使NE神经元递质合成增多，寒凉药使5HT合成增多。药性越寒凉，需要更多5HT合成前体用于5HT合成，尿液代谢中参与色氨酸代谢途径的物质含量就会减少。L色氨酸、犬尿氨酸、烟酸主要参与色氨酸的代谢[89]。而可能存在的生物标记物L色氨酸、犬尿氨酸、烟酸在大鼠尿液中的含量高低依次为干姜制黄连组、鲜姜制黄连组和生黄连组，提示其寒性由弱渐强；干姜汁组的L色氨酸、犬尿氨酸、烟酸的含量高于鲜姜汁组，也与辅料干姜汁性热、鲜姜汁性温的结论相吻合。

机体与能量的有关代谢主要为糖代谢过程和氨基酸代谢等。在糖代谢中，产生三磷酸腺苷（ATP）的主要环节包括糖酵解和三羧酸循环[10]。在氨基酸代谢过程中，可以通过脱氨作用、转氨作用以及联合脱氨或脱羧作用，分解成α酮酸、胺类及二氧化碳，氨基酸分解后所生成的 α酮酸可以转变成糖、脂类或再合成为某些非必需氨基酸，也可以经过三羧酸循环氧化成二氧化碳和水，并放出能量[11]。本实验中，参与氨基酸代谢的可能生物标记物肌氨酸、肌酐、L脯氨酸、络氨酸的含量依次为干姜制黄连组、鲜姜制黄连组和生黄连组，干姜汁组鲜高于姜汁组含量，同样提示黄连经不同药性姜汁辅料炮制后对其能量代谢产生不同影响。

此外，黄连还具有抗炎、 阻止儿茶酚胺的生物合成及抑制中枢神经等作用， 其中， 黄连的抗炎作用机制主要表现在对某些炎性细胞和炎性介质的影响[1.2.1.3]。花生四烯酸是炎性介质白细胞三烯B4的前体[14]，对动物机体有抗炎的作用。本实验中，生黄连组中花生四烯酸的含量较鲜姜制黄连组、干姜制黄连组低，且辅料组鲜姜汁组的含量也低于干姜汁组。该结果提示，黄连经姜制后，抗炎作用有所增加，同时，不同姜汁由于其药性差异对药物抗炎作用产生不同的影响。研究结果为将来不同姜汁作为炮制辅料的适宜应用提供科学依据。

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