关岭黄牛ANGPTL4基因多态性与生长性状关联分析
材料与方法
1.1 试验材料
92头关岭黄牛全血样采自贵州省关岭县种群核心保种区。采取的黄牛全血样肝素抗凝，放入冰盒中带回实验室-80 ℃ 保存备用。在采样的同时，对各个体的生长性状、体长数据进行测定。
1.2 基因组DNA的提取
采用蛋白酶K和TaKaRa Blood Genome DNA Ex-traction Kit（购于北京天根生物公司）提取基因组DNA。
1.3 引物设计和PCR扩增
根据在GenBank 中登录的牛ANGPTL4基因序列（GenBank登录号为NC 007305.4），使用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计1对引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息见表1。
PCR反应体系为20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix10 μL，购于北京天根生物公司；上下游引物各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 6 μL。PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存备用。
1.4 PCR产物的测序
将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收扩增片段，送生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
1.5 数据统计与分析
用DNAstart软件包中的SeqMan对测序所得的序列进行校对，用Clustalx程序进行同源性比对。基因型频率、等位基因频率、杂合度等群体遗传参数采用Popgene生物技术软件处理。运用SPSS 13.0分析生长性能数据及关联性。
2 结果与分析
2.1 ANGPTL4基因SNP检测
由图1可见，关岭黄牛ANGPTL4基因PCR扩增片段长度为752 bp，经测序检测发现，387 C>T、418 C>T、449 A>T等3个突变位点均存在2种基因型。
2.2 关岭黄牛ANGPTL4基因多态性分析
由表2可见，3个变异位点均是杂合子基因型为优势基因型。387 C>T变异位点C等位基因频率小于T等位基因，418 C>T变异位点C等位基因频率大于T等位基因，449A>T变异位点A等位基因频率大于T等位基因。HWE检测结果表明，3个变异位点均处于HWE不平衡状态（P<0.05）。3个变异位点的杂合度 （He） 介于0.441 9～0.492 7之间，有效等位基因（Ne）介于1.784 1～1.960 8之间，多态信息含量（PIC）均呈现中度多态。
2.3 关岭黄牛ANGPTL4基因多态位点与生长性状关联性分析
如表3所示，将关岭黄牛ANGPTL4基因多态位点与关岭黄牛体高、体斜长、胸围、腹围、管围、十字部高、坐骨端宽 7个生长性状指标进行关联性分析，418 C>T变异位点CT基因型个体体高、体斜长、胸围、腹围极显著大于CC基因型；449 A>T变异位点AA基因型个体体高显著大于AT基因型，胸围、腹围极显著大于AT基因型。
3 结论与讨论
候选基因法是一种寻找畜禽重要经济性状遗传标记的常用方法，它可以直接研究该基因多态性与个体经济性状的关系。本研究通过测序方法对关岭黄牛的ANGPTL4基因进行多态性分析，并与生长性状进行关联性分析。结果发现，3个变异位点均具有2种基因型。从进化角度看，群体中的遗传多样性是历史的产物[11]，多态性信息含量和杂合度都是群体内遗传变异的重要度量指标，杂合度值越大，群体内的遗传变异就越大。多态信息含量值衡量基因变异程度高低，Botstein等提出衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC>0.5 时，该变异位点为高度多态；当0.25 ANGPTL4蛋白是一种具有广泛生理功能的物质，尤其对脂代谢的调控具有重要作用，脂代谢影响肉质的嫩度、风味和多汁性，脂肪性状是衡量肉质的重要指标之一。因此，研究ANGPTL4基因的突变对对牛生长发育的影响具有重要的理论和实践意义。本研究中发现，418 C>T变异位点CT基因型个体体高、体斜长、胸围、腹围极显著大于CC基因型；449 A>T变异位点AA基因型个体体高显著大于AT基因型，胸围、腹围极显著大于AT基因型。因此，ANGPTL4基因完全可以作为牛生长性状的潜在遗传标记，为贵州黄牛肉用性能分子育种提供理论依据。 参考文献： [1]Hato T，Tabata M，Oike Y. The role of angiopoietin-like proteins in angiogenesis and metabolism[J]. Trends in Cardiovascular Medicine， 2008，18（1）：6-14. [2]Adachi H，Fujiwara Y，Kondo T，et al. Angptl 4 deficiency improves lipid metabolism，suppresses foam cell formation and protects against atherosclerosis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，379（4）：806-811. [3]Aronsson L，Huang Y，Parini P，et al. Decreased fat storage byLactobacillus paracasei is associated with increased levels of angiopoietin-like 4 protein （ANGPTL4）[J]. PLOS One，2010，5（9）：13087. [4]Kaddatz K，Adhikary T，Finkernagel F，et al. Transcriptional profiling identifies functional interactions of TGF β and PPAR β/δ signaling：synergistic induction of angptl 4 transcription[J]. The Journal ofBiological Chemistry，2010，285（38）：29469-29479. [5]Sukonina V，Lookene A，Olivecrona T，et al. Angiopoietin-likeprotein 4 converts lipoprotein lipase to inactive monomers and modulates lipase activity in adipose tissue[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，2006，103（46）：17450-17455. [6]Lichtenstein L，Berbée J F，van Dijk S J，et al. Angptl 4 upregulates cholesterol synthesis in liver via inhibition of LPL-and HL-dependent hepatic cholesterol uptake[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology，2007，27（11）：2420-2427. [7]朱洪新，李锦军，覃文新，等. 新基因ANGPTL4的克隆及其在血管新生中的功能研究[J]. 中华医学杂志，2002，82（2）：94-99. [8]Kster A，Chao Y B，Mosior M，et al. Transgenic angiopoietin-like （angptl）4 overexpression and targeted disruption of angptl4 andangptl3：regulation of triglyceride metabolism[J]. Endocrinology，2005，146（11）：4943-4950. [9]Xu A，Lam M C，Chan K W，et al. Angiopoietin-like protein 4decreases blood glucose and improves glucose tolerance but induceshyperlipidemia and hepatic steatosis in mice[J]. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（17）：6086-6091. [10]马 云. 牛三个基因的分离、定位及其牛经济性状的关联研究[D]. 杨凌：西北农业科技大学，2006. [11]Nei M，Tajima F，Tateno Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data[J]. Journal of Molecular Evolution，1983，19（2）：153-170. [12]Valizadeh M，Kang K K，Kanno A，et al. Analysis of genetic distance among nine Medicago species by using DNA polymorphisms[J]. Breeding Science，1996，46（1）：7-10.