绿色木霉菌发酵液对杧果炭疽菌的生长抑制及细胞损伤作用

摘要：【目的】为探求绿色木霉菌发酵液对杧果炭疽菌的抑制机制，【方法】以杧果炭疽菌为供试菌，研究绿色木霉菌及其发酵液对杧果炭疽菌菌丝生长、孢子萌发、无机磷的吸收、细胞通透性的影响。【结果】绿色木霉菌发酵液处理后杧果炭疽菌菌丝严重枯萎变形；处理24 h，孢子萌发率比对照组低86.40%；无机磷吸收基本停止；核酸、蛋白质等大分子渗漏严重；杧果炭疽菌胞内可溶性蛋白及还原糖含量明显少于对照组。【结论】绿色木霉菌发酵液能够破坏杧果炭疽菌细胞的完整性，抑制杧果炭疽菌生长。

关键词： 绿色木霉菌； 发酵液； 杧果炭疽菌； 生长抑制； 细胞损伤

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2012？雪06-1097-06

杧果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）是杧果果实采前及采后的主要病原真菌，具潜伏侵染性，可引起贮藏期间的杧果30%～50%腐烂。中国、美国、印度、巴西、菲律宾、泰国、印度尼西亚、刚果等国均有报道。人们已经研究了肉桂[1]、石菖蒲[2]、香根草[3]等提取挥发油对炭疽菌的菌丝生长、孢子萌发的抑制作用[4]，以及温度、湿度[5]、光照[6]等环境因素对孢子萌发的影响，但植物提取物成本高，原材料受生长季节和地域的限制，难以在杧果采后保鲜处理的生产中推广应用。利用拮抗微生物定向发酵技术，生产抑菌防腐物质，发酵条件和工艺皆可控制，为实现低成本的连续工业化生产提供了可能性，这是天然果蔬防腐保鲜剂的重要研究方向。

木霉菌（Trichoderma）是一类自然界普遍存在的真菌。其中，绿色木霉菌（T. viride）、哈茨木霉菌（T. harzianum）、康氏木霉菌（T. koningii）、钩状木霉菌（T. hamatum）和长枝木霉菌（T. longibrachiatum）等对农作物田间真菌病害具拮抗作用[7-9]。绿色木霉菌具有适应性强，繁殖速度快、对植物病原真菌具广谱拮抗作用等优点，已成为人们研究的热点[10-11]。国内外对绿色木霉菌生物防治作用的拮抗机制，农作物病害防治应用进行了研究[12-14]，但未见绿色木霉菌发酵液对杧果炭疽菌菌丝生长的抑制及细胞损伤的报道。本试验研究绿色木霉菌发酵液对杧果炭疽菌菌丝生长的抑制作用，以及对其细胞完整性的影响，以期探求抑菌作用机制，为绿色木霉菌发酵液用于杧果采后保鲜处理提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

绿色木霉菌 （T. viride），购于广东省微生物研究所；杧果炭疽菌（C. gloeosporioides Penz），华南农业大学微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 T. viride发酵液的制备 参照蒋雨[15]方法，200.0 g马铃薯，10.0 g玉米粉，20.0 g葡萄糖，1.0 g吐温-80，1.0 L水。T. viride经活化，制成106 CFU·mL-1孢子悬液，250 mL锥形瓶中加50 mL培养基，接种量1.0%（v/v），于32.5 ℃，125 r·min-1，培养7 d。发酵液经孔径0.22 μm滤膜过滤，除去孢子，50 ℃真空旋转蒸发浓缩至1/25体积，得样液，4 ℃贮存备用。

1.2.2 T. viride对C. gloeosporioides的抑制作用

参照黄雪莲[16]方法，采用一点对峙培养法。分别在新培养好的绿色木霉菌和杧果炭疽菌菌落上，取生长能力一致的同心圆处切取直径为5 mm的菌饼，接种到PDA平板中，两接种点相距50 mm，以只接种杧果炭疽菌为对照，30 ℃恒温培养7 d，观察，拍照。

1.2.3 T. viride发酵液对C. gloeosporioides生长的影响 参照方中达[17]方法，采用载片培养法，在90 mm培养皿中倒上薄薄一层含T. viride发酵液的PDA培养基，凝固后用灭菌的手术刀切取20 mm×30 mm薄片，置于无菌载玻片中央，挑取C. gloeosporioides菌丝接种于小方块两边平行的中点，盖盖玻片，放入培养皿内下层垫有湿润滤纸的玻棒上，以无T. viride发酵液的PDA培养基为对照，30 ℃恒温保湿培养，逐日观察。拍摄（OLYMPU S BX63光学显微镜，日本OLYMPUS公司）。

1.2.4 T. viride发酵液对C. gloeosporioides孢子萌发的影响 参照陶金华等[18]的方法， T. viride发酵液与C. gloeosporioides孢子悬液各1.0 mL置于试管中，加棉塞，摇匀，30°倾斜放置。以等体积无菌培养基与C. gloeosporioides孢子悬液混匀为对照，30 ℃培养，于6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h取20 μL于载玻片，显微测量100个孢子的萌发情况，统计孢子萌发状况（以芽管长度超过孢子短直径的一半作为萌发标准）。

孢子萌发率（%）=孢子萌发数/总孢子数×100

1.2.5 T. viride发酵液对C. gloeosporioides磷吸收的影响 参照翟培等[19]的方法，将活化后的C. gloeosporioides转接到液体培养基，30 ℃培养72 h，离心（3 000 r·min-1，5 min），沉淀用0.1 mol·L-1 pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释成106 CFU·mL-1菌液。取0.5 mL菌液和0.5 mL葡萄糖溶液（1.0 g·L-1）于离心管内，加200 μL 0.026 mol·L-1磷标准液和200 μL T. viride发酵液，在0.0、3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h取样0.1 mL，加入0.6 mol·L-1 三氯乙酸、硫酸亚铁-钼酸铵试剂，于660 nm比色（DU730紫外及可见分光光度计，美国Beckman coulter Inc）测总磷含量。等体积无菌水为对照。

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