杂种杨树木葡聚糖内糖基转移酶基因（XET）的生物信息学分析

摘要  [目的]通过生物信息学方法对杂种杨树木葡聚糖内糖基转移酶基因的DNA序列、蛋白质序列进行分析预测，为进一步研究奠定基础。[方法] 以XET基因及其氨基酸序列为研究对象，利用多种网络数据库及生物信息学软件对其进行分析预测。[结果]该基因编码290个氨基酸残基，相对分子质量33 672.0 D，理论等电点（pI）7.04;该酶可能存在3个卷曲结构部位、1个信号肽剪切位点和1个跨膜区，是典型的分泌蛋白;三级结构同源建模预测结果较好，二级结构预测中的螺旋、卷曲和折叠均可见。相似性比对和进化分析显示其与葡萄等的序列相似度较高;而蛋白质三级结构的预测则发现，该酶与几种杆菌的蛋白较接近。[结论]XET基因可能在很多生物中具有较高的保守性。

关键词 杨树;木葡聚糖内糖基转移酶;生物信息学

中图分类号 S792.11 文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2014）34-12132-05

Bioinformatics Analysis of Populus alba × Populus tremula var. glandulosa Xyloglucan Endotransglycosylase （XET） Gene

ZHAO Hui1， WANG Sui1， LIU Xiaoping2， LI Kailong1* et al  （1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040; 2. Jilin Linjiang Forestry Bureau， Linjiang， Jilin 134600 ）

Abstract  [Objective] Analyze and predict the structure and feature of Populus alba × Populus tremula var. glandulosa xyloglucan endotransglycosylase （XET） gene/protein sequence through bioinformatics method， and pave the way for the downstream experiments. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict XET gene and its corresponding protein. [Result] XET gene encodes 290 aa; protein molecular weight is 33 672.0 D， theoretical isoelectric point is 7.04; XET contains 3 coiled coils， 1 signal peptide and 1 transmembrane domain indicating that it is a typical secretory protein; prediction of secondary structure and homologous modeling of tertiary structure both returned rational results. [Conclusion] It is possible that XET gene possesses high conservation in different species.

Key words  Populus alba × Populus tremula var. glandulosa; Xyloglucan endotransglycosylase; Bioinformatics

木葡聚糖内转糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）是一类细胞壁松弛酶，属于糖苷水解酶家族，在细胞伸长过程中扮演重要角色[1]。研究表明，在细胞快速伸长期伴有XET基因的表达，且XET的活性与细胞、组织的伸长呈正相关。XET促进细胞伸长是通过改变细胞壁网络结构引起的细胞壁松弛来实现的，在该过程中木葡聚糖既是供体又是受体。首先，XET内分解木葡聚糖多聚体，使纤维素纤维丝分离，改变木葡聚糖/微纤维丝网络结构，导致细胞壁松弛和细胞扩展;随后XET将新形成的还原末端连接到其他含非还原末端的木葡聚糖多聚体上，使细胞壁恢复其稳定结构[2]。近来的研究还发现，XET在次生壁沉积的早期阶段起作用，可能加强了初生和次生壁之间衔接[3]。因此，XET基因在细胞壁生物工程、植物生长、细胞壁结构及其物理特性改善等领域都有重要意义[4-5]。笔者通过较为全面的生物信息学分析方法对杂种杨树（Populus alba × Populus tremula var. glandulosa）XET基因的DNA序列、RNA序列和蛋白质序列进行了分析，并对其蛋白质的结构与功能进行了预测，以期为进一步研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 所用材料杨树木葡聚糖内糖基转移酶基因（XET）的NCBI登录号为JX431932。

1.2 方法

使用NCBI中的Nucleotide数据库获取核酸序列相关信息。蛋白质理化性质预测使用ProtParam，酶切特性的预测使用DNAstar和BioEdit，亲疏水性分析使用ProtScale软件，信号肽预测使用SignalP4.1在线软件包，磷酸化和糖基化位点的预测使用NetPhos2.0和NetOGlyc3.1。蛋白质二级结构的预测分别使用PredictProtein和PSIPRED v3.0 2种预测工具。三级结构的预测则使用SwissModel Workspace同源建模网络综合服务器。利用NCBI数据库Blast功能进行序列相似性查询，进而通过ClustalX、DNAMAN和MEGA5.05进行多序列比对并构建进化树。

2 结果与分析

2.1 杨树木葡聚糖内糖基转移酶一级结构分析

2.1.1 核酸序列分析。

利用该基因的登录号，在Nucleotide数据库中检索并得到该基因的相关信息，结果显示该基因的完整转录序列总长1 141 bp，5’UTR长146 bp，3’UTR长122 bp，其CDS起始于ATG，终止于TAA，共873 bp，编码290个氨基酸残基。氨基酸序列见图1。

图1 氨基酸序列

2.1.2 氨基酸序列及蛋白质特性分析。

通过ProtParam软件，在线检测杨树木葡聚糖内糖基转移酶的蛋白质序列理化参数，得出XET氨基酸数目为290个，相对分子质量33 672.0 D，理论等电点（pI）7.04。在整个氨基酸序列中，天门冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phe）含量最高，均为22个氨基酸，占总数的7.6%;而半胱氨酸（Cys） 含量最低，仅5个，占总数的1.7%。分子式为C1536H2262N402O431S13，脂肪系数（疏水值）为62.90，总平均亲水性（GRAVY）为-0.450。

2.1.3 杨树木葡聚糖内糖基转移酶酶切特性预测。

首先利用BioEdit分析该基因的限制性位点，进而找到不能切割该蛋白的酶（图2）。然后利用DNAstar软件包中的Protean对该蛋白进行模拟酶切预测，结果见图3。

图2 不能切割该序列的限制性内切酶

图3 蛋白酶酶切位点

2.1.4 杨树木葡聚糖内糖基转移酶亲疏水性分析。

利用ProtScale软件来绘制杨树木葡聚糖内糖基转移酶亲疏水性列谱，以预测其折叠情况。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法进行预测。结果发现，该蛋白质仅存在1个高分值峰（分值>1.5），分布在10～20等域;而3个低分值（分值<0）的峰分别位于100～110、130～140、240～250氨基酸位点附近（图4），预测该3个位置为蛋白质的卷曲结构部位。

2.1.5 杨树木葡聚糖内糖基转移酶信号肽和亚细胞定位预测。

利用SignalP4.1在线软件包对该蛋白质进行信号肽等的预测。物种选择真核生物，其余使用默认参数进行预测。结果表明，其中C值最高为0.667，出现在第20个氨基酸T上，Y值最高为0.801，同样出现在第20个氨基酸T上（图5），基于Ymax判定，杨树木葡聚糖内糖基转移酶具有信号肽，，其最可能的剪切位点位于第19和第20位之间，是一个典型的分泌蛋白。

图4 ProtScale亲疏水性分析预测结果

图5 SignalP信号肽预测结果

2.1.6 杨树木葡聚糖内糖基转移酶氧糖基化位点预测。

蛋白质的糖基化是指在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键的过程。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。利用在线预测软件NetOGlyc3.1对杨树木葡聚糖内糖基转移酶氧糖基化位点进行预测。结果显示，该酶没有氧糖基化位点。

2.1.7 杨树木葡聚糖内糖基转移酶激酶磷酸化修饰位点预测。

蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、络氨酸）上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。利用NetPhos2.0进行在线的磷酸化位点预测。结果表明，杨树木葡聚糖内糖基转移酶可能存在7个丝氨酸（Ser）、0个苏氨酸（Thr）和5个络氨酸（Tyr）的磷酸基化位点（图6）。

图6 NetPhos磷酸化位点预测结果

安徽农业科学                         2014年

图7 PSIPRED预测蛋白质二级结构结果

2.2 杨树木葡聚糖内糖基转移酶二级结构预测

使用PredictProtein预测该蛋白质的二级结构，使用默认参数进行预测。结果显示，该蛋白是一个alphabeta混合型蛋白，其中螺旋（H）占8.62%，折叠（E）占34.14%，环（L）占57.24%。对其二硫键的预测结果显示该蛋白没有完整的二硫键。此外，对蛋白质功能位点的预测结果显示该蛋白质含有氮糖基化、磷酸化和豆蔻酰化位点。

此外，通过PSIPRED平行进行蛋白质二级结构预测。使用PSIPRED v3.0，通过PSIBLAST搜索同源序列进而预测二级结构。结果与PredictProtein预测较相似（图7）。

2.3 杨树木葡聚糖内糖基转移酶三级结构预测

使用SwissModel Workspace同源建模网络综合服务器对蛋白质三级结构进行预测，使用自动方式（Automated Mode），得出蛋白质三级结构模型见图8。对构建好的模型进行全局和局部的评估。全局法中QMEANscore4的得分为0.68，模型质量较好。而局部法则显示预测模型的健康度较好。而其序列相似性的比对结果显示其与1umz_1（杆菌）极为相似。

2.4 杨树木葡聚糖内糖基转移酶与其他物种的相似性比对以及进化分析

2.4.1 核酸序列的Blast比对。

使用BlastP对其进行氨基酸相似性比对，发现除杨树相关杂交种外，杨树木葡聚糖内糖基转移酶氨基酸序列还与美味猕猴桃（Actinidia deliciosa，AAC09388.1）、垂枝桦（Betula pendula，ABB72441.1）、柿树（Diospyros kaki，AEQ37176.1）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002274520.1）、沙梨（Pyrus pyrifolia，CA02823.1）、苹果（Malus  domestica，N07897.1）、旱金莲Tropaeolum majus，AAB39950.1）等的氨基酸序列相似性较高，相似度依次为93%、92%、91%、94%、90%、90%和85%。

2.4.2 多序列比对。

应用ClustalX和DNAMAN将杨树木葡聚糖内糖基转移酶基因所编码的蛋白质与美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）、垂枝桦（Betula pendula）、柿树（Diospyros kaki）、葡萄（Vitis vinifera）、沙梨（Pyrus pyrifolia）、苹果（Malus  domestica）、旱金莲（Tropaeolum majus）等XET相关蛋白质的氨基酸序列进行进行多序列比对，发现XET相关基因同源性很高（图9）。

图8 蛋白质三级结构预测结果

2.4.3 基于进化距离的进化树构建。

继续使用MEGA5对上述8种生物的进化距离进行估计，其中差异估算方法使用pdistance，得到的结果见图10。

进而使用MEGA5进行进化树构建，使用NJ法，检验方法选择“Bootstrap method”，抽样次数为500。进化树见图11。通过对XET比对发现杨树与葡萄等的亲缘关系较近。

3 讨论

通过生物信息学的方法对杨树木葡聚糖内糖基转移酶基因的DNA序列、蛋白质序列进行了分析，并对蛋白质的结构与功能进行了预测。一级结构预测发现，该基因编码290个氨基酸残基，相对分子质量33 672.0 D，理论等电点（pI）7.04;蛋白质的结构分析显示该酶存在3个卷曲结构部位，第19和第20位氨基酸间存在信号肽剪切位点，有12个磷酸化位点和1个氮糖基化位点，存在1个跨膜区，无二硫键，是一个典型的分泌蛋白。对整个XET基因家族进行分析，发现

图9 不同物种木葡聚糖内糖基转移酶多序列比对分析

图10 两两序列间进化距离

图11 Bootstrap检验过的一致树

其大都具有相对保守的糖基化位点，其催化活性位点为

EIDFE[2]，而在杨树木葡聚糖内糖基转移酶基因亦发现了该片

段，位于110个氨基酸附近，从侧面验证了预测的准确性;三级结构同源建模预测结果较好，二级结构预测中的螺旋、卷曲和折

叠均可见。对该酶的DNA序列进行Blast，进而构建进化树，发现其与葡萄等的序列相似度较高;而蛋白质三级结构的预测则发现，该酶与几种杆菌的蛋白较接近，表明其结构可能在很多生物中具有保守性。

参考文献

[1]

JOHANSSON P，BRUMER H，BAUMANN M J，et al.Crystal structures of a poplar xyloglucan endotransglycosylase reveal details of transglycosylation acceptor binding[J]. The Plant Cell Online，2004， 16（4）： 874-886.

[2] 王旭静， 王志兴， 贾士荣. 海岛棉Gbxet基因的克隆及过量表达对酵母细胞伸长的影响[J]. 农业生物技术学报，2005（3）：276-281.

[3] NISHIKUBO N，AWANO T，BANASIAK A，et al. Xyloglucan endotransglycosylase （Xet） functions in gelatinous layers of tension wood fibers in poplar—a glimpse into the mechanism of the balancing act of trees[J]. Plant and Cell Physiology，2007， 48（6）： 843-855.

[4] LU W J， NAKANO R，KUBO Y，et al.Cloning and expression analysis of an Xet Cdna in the peel and pulp of banana fruit ripening and softening[J]. 植物学报：英文版， 2004，46（3）：355-362.

[5] 李伟， 李娜， 陈晓阳. 团花树木葡聚糖转葡糖苷酶 Cdna 克隆及序列分析[J].北京林业大学学报，2010（5）：45-49.

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