卫气虚模型大鼠血浆代谢标志物月节律变化的研究
材料
1.1 动物
6周龄健康雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量160～200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于河北中医学院动物实验中心恒温、通风、安静的环境，自由进食饮水，每日更换垫料，定期给鼠笼消毒。
1.2 主要试剂与仪器
乙腈、甲醇，色谱级，美国Fisher Scientific公司；蒸馏水，屈臣氏；色谱柱，美国phenomenex公司；乙酸、乙酸铵，色谱级，中国Dikmapure公司。高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（HPLC-MS），美国AB公司；液相系统，ekspertTM ultraLC100；质谱系统，AB Sciex QTRAP 4500，配有EI、离子肼；涡旋振荡器，QL-901，Vortex，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；液氮罐，YDS-10，河南新乡市新亚低温容器有限责任公司；MDF-382E型超低温保存箱，日本三洋公司；高速台式冷冻离心机，TGL-16M，湖南湘仪离心机仪器有限公司。
2 实验方法
2.1 分组及造模
以秋分日所在农历月，确定月初取材时间为2013年农历八月初一正午12：00、月中取材时间为2013年农历八月十五正午12：00、月末取材时间为2013年农历八月三十正午12：00。每次实验取材日前2周，将20只大鼠按随机数字表法分为正常组和模型组，每组10只，适应性喂养7 d后造模。其中月初正常组大鼠体质量为（173.89±8.61）g，模型组大鼠体质量为（181.96±9.21）g；月中正常组大鼠体质量为（179.64±10.09）g，模型组大鼠体质量为（184.09±10.65）g；月末正常组大鼠体质量为（180.16±7.95）g，模型组大鼠体质量为（177.65±7.86）g，各组大鼠体质量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。正常组常规饲养，模型组给予疲劳联合寒热交替法造模[4-5]。模型组大鼠先在20 ℃左右常温水中游泳30 min，再取出，常规饲养，室温（25±1）℃，0.5 h后，将大鼠放入（40±1）℃恒温箱中15 min，再0.5 h后将大鼠放入-20 ℃冰柜中20 min进行寒冷刺激。以上过程每日1次，连续7 d。造模成功标准参考文献[4，6-7]制定：大鼠蜷缩、扎堆、怕冷、恶风；背毛凌乱、无光泽，汗出明显；喷嚏，有痰鸣音及鼻分泌物；反应迟钝，懒动。
2.2 样本采集与制备
取材前1 d开始禁食，24 h后大鼠断头处死，血液中加肝素钠20 μL，3500 r/min离心10 min，取上清液于冻存管中，液氮暂存，转-80 ℃冰箱保存。检测前血浆置4 ℃条件下复融。乙腈预冷提前在4 ℃条件下过夜。按100 μL血浆加300 μL乙腈比例沉淀蛋白，涡旋混匀，14 000 r/min离心10 min，取上清液，与水按1∶1稀释配比，14 000 r/min离心10 min。将上清液移入液相小瓶中备用待测。
2.3 代谢物检测
供试血浆样品用HPLC-MS检测。色谱条件：色谱柱为phenomenex Kinetex XB-C18（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流动相：A为水（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸铵溶液），B为乙腈（含0.05%乙酸，2 mmol/L乙酸铵溶液）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃，进样量：5 μL。梯度洗脱条件设置见表1。质谱条件：正离子（ESI+）模式下进行检测，质谱检测数据采集范围：质荷比50～850 Da；Curtain Gas：30 psi，Gas1：55 psi，Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。
3 统计学方法
应用markerview1.2.1代谢组学分析软件进行峰识别、峰过滤、峰对齐，最终获得包括质荷比、保留时间及峰面积的二维数据阵。采用SIMCA13.0.3软件对数据进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）[8]。将分析结果结合网上数据库检索鉴定可能的生物标志物。通过代谢组学分析软件行t检验，分析标志性代谢物的组间差异。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
采用PLS-DA的重要变量因子（阈值>1），并结合t检验P值（P<0.05）来寻找差异性表达代谢物。筛选确定候选代谢物后，搜索在线数据库进行检索，查找可能的代谢物，进一步缩小范围，分析推测代谢物。
4.1 月初卫气虚潜在标志物
在正离子模式下，经过PLS-DA，具有4个主成分，R2X=0.539，R2Y=0.994，Q2=0.86；PLS-DA得分图显示正常组与模型组被第一主成分完全分开，表明2组间有显著差异，见图1。模型组和正常组结果显示，预测能力Q2=0.86，53.9%X变量可用于解释2组间99.4%的差异Y。适合于解释2组间的代谢差异和发现2组间的差异性表达代谢物。结果在正离子模式下初步比对并推测出油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮质醇、脯氨酸、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸6种差异代谢物为月初卫气虚证潜在证候标志物，见表2。
4.2 月中卫气虚潜在标志物
在正离子模式下，经过PLS-DA，具有2个主成分，R2X=0.335，R2Y=0.999，Q2=0.968；PLS-DA得分图显示正常组与模型组被第一主成分完全分开，表明2组间有显著差异，见图2。模型组和正常组结果显示，预测能力Q2=0.968，33.5%的X变量可用于解释2组间99.9%的差异Y。适合于解释2组间的代谢差异和发现2组间的差异性表达代谢物。结果在正离子模式下初步比对并推测出1-磷酸鞘氨醇、苹果酸、皮质醇、油酸酰胺、肉毒碱、二十碳五烯酸、富马酸二甲酯7种差异代谢物为月中卫气虚证潜在证候标志物，见表3。
4.3 月末卫气虚潜在标志物
在正离子模式下，经过PLS-DA，具有2个主成分，R2X=0.202，R2Y=0.989，Q2=0.708；PLS-DA得分图显示正常组与模型组被第一主成分完全分开，表明2组间有显著差异，见图3。模型组和正常组结果显示预测能力Q2=0.708，20.2%的X变量可用于解释2组间98.9%的差异Y。适合于解释2组间的代谢差异和发现2组间的差异性表达代谢物。结果在正离子模式下初步比对并推测出胆固醇乙酸酯、苏氨酸、皮质醇、富马酸二甲酯、油酸酰胺、二十碳五烯酸、焦谷氨酸7种差异代谢物为月末卫气虚证潜在证候标志物，见表4。
4.4 卫气虚月周期差异性代谢物挖掘
依据月初、月中、月末3个时间点卫气虚潜在证候标志物，其中油酸酰胺、皮质醇、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸4种差异性代谢物同时出现在3次实验中，推测这4种物质影响了卫气虚证月周期性变化。
5 讨论
卫气具有防御、调节、温煦等功能，如《灵枢·本藏》所言“卫气者，所以温分肉，充皮肤，肥腠理，司开合者也”。卫气虚证是卫气的功能减弱降低，其属于中医诊断学的一个基本证型，又名肺卫气虚不固证、肺虚表疏证，指肺气虚弱、卫表不固的证候。症见恶风、自汗、时常感冒、气短乏力、舌淡脉弱等。卫气虚证是机体在疾病发展过程中某个阶段的病理概括，能够反映疾病特定阶段病理变化的本质。每个证候都有其外在证象与内在本质，外在证象通过四诊所获信息辨证所得，而出现外在证象的根本在于内在本质，中医将其本质归结于五脏病变与气血阴阳失调。然而这种解释难以从现代医学角度阐释证的本质，中西医结合医学认为中医证的发生、发展必然有其相应的物质基础，这些物质决定了证候发生发展的动态变化[9]。有学者从免疫功能、神经调节、热代谢等方面阐述卫气与卫气虚的本质[10-11]，这些研究都从不同层面对卫气虚证本质做出解释，但忽略了整体观念。代谢组学具有整体性、系统性、综合性的特点，将生物体作为一个完整的系统研究，能够多靶点、多层面网络式反映机体内部整体性变化，故本研究采用代谢组学方法研究卫气虚证的物质基础。并结合《内经》所言的卫气月节律循行特点，采取与之相应的动态检测方式，观察卫气虚证代谢标志物的月周期变化。
本研究结果显示，油酸酰胺、磷脂酰甘油、皮质醇、脯氨酸、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸、1-磷酸鞘氨醇、苹果酸、肉毒碱、胆固醇乙酸酯、苏氨酸、焦谷氨酸等差异代谢物可能为卫气虚证潜在证候标志物，其中油酸酰胺、皮质醇、富马酸二甲酯、二十碳五烯酸4种潜在证候标志物贯穿于卫气虚证月周期变化的始终。这些物质的变化涉及能量代谢，还包括了激素、细胞、神经调节。其中油酸酰胺最早发现于动物脑脊液中，能诱导动物产生生理性睡眠[12]，属内源性脂肪酰胺，具有生理及神经调节作用。研究表明，油酸酰胺对小鼠产生显著的镇静作用，并能拮抗中枢兴奋剂的动物兴奋作用，增加慢波睡眠[13]。此外，油酸酰胺对5-羟色胺能神经传递具有调节作用，表明其具有外周及中枢神经调节的功能。中医认为，卫气的昼夜循行与人体寤寐密切相关，油酸酰胺则可能是卫气调节人体寤寐的重要物质之一，同时也是卫气受神经调节的有利证明。二十碳五烯酸是n-3多不饱和脂肪酸，属必需长链不饱和脂肪酸，通过调节脂肪酸合成和β-氧化改善脂肪酸、三酰甘油代谢。同时具有抗肿瘤、降血糖、保护肾脏、改善胰岛素抵抗、防治心脑血管疾病的作用[14-15]。富马酸二甲酯能够调节细胞氧化还原系统[16]及免疫炎症[17]，被认为是具有无重大免疫抑制的免疫调节剂。皮质醇是一种糖皮质激素，可以调节糖、蛋白质以及脂肪的代谢，对维持血压稳定和控制机体的炎症反应有重要作用[18]。这3种物质均与免疫功能相关，对人体的能量代谢平衡，保护机体防治脏腑疾病有重要意义，这与卫气的卫外固护、温养脏腑的功能相一致。这些差异性代谢物质含量的变化势必影响到卫气的功能，当其失衡时则出现卫气功能下降，即卫气虚证的表现。这些代谢标志物的发现表明，卫气虚证的月周期性变化可能与能量代谢有关，同时还伴随着细胞、激素与神经调节，是机体整体多层面网络式的变化过程。
本研究首次应用代谢组学方法探讨卫气虚的物质基础，并结合卫气月节律采取与其相一致的动态检测方式，观察卫气虚证潜在标志物的月周期变化。以期为中医证候学提供客观依据，为卫气学说研究提供新的途径，揭示卫气及卫气虚的本质。由于动物实验的局限性，研究尚存在不足。课题组将在此基础上进行人体大样本研究，以期更为全面阐释卫气的实质。
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