基于气相色谱—质谱技术的小青龙汤证大鼠血液代谢组学研究
摘要：目的 采用气相色谱-质谱法（GC-MS）测定小青龙汤证大鼠血液中内源性代谢物，为小青龙汤证本质研究提供依据。方法 将36只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组10只、模型组13只和小青龙汤组13只，模型组和小青龙汤组制作外寒内饮（小青龙汤证）模型，小青龙汤组灌胃小青龙汤，空白对照组不作任何处理。 15 d后，3组大鼠腹主动脉取血，进行GC-MS检测。图谱经预处理后采用偏最小二乘法-判别分析进行多元统计分析。结果 发现13种小分子标志物，分别为乳酸、3-羟基丁酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、葡萄糖、花生四烯酸等代谢物质。结论 乳酸、甘氨酸等标记物集中表现为能量代谢、免疫功能和炎症反应，为小青龙汤证本质研究提供了物质基础。
关键词：气相色谱-质谱；血液；小青龙汤证；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.023
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0083-04
Metabonomics Study on Blood of Rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome Based on GC-MS ZHAO Xiao-hua1， HE Li-qing1， GAI Jiang-hua2 （1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China；2.Changzhi Chinese Medicine Hospital， Changzhi 046000， China）
Abstract：Objective To determine the endogenous metabolites in blood of rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome by using GC-MS；To provide evidence for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome. Methods Totally 36 male Wistar rats were randomly divided into blank control group （10 rats）， model group （13 rats）， and Xiaoqinglong Decoction group （13 rats）. Model group and Xiaoqinglong Decoction group were used to make the models of exogenous cold and internal fluid syndrome （Xiaoqinglong Decoction Syndrome）. Rats in Xiaoqinglong Decoction group received gavage with Xiaoqinglong Decoction， while rats in blank control group received nothing. Blood of rats in the three groups was taken from the abdominal aorta and detected by GC-MS 15 days later， and analyzed by multivariate statistical analysis with PLS-DA. Results 13 kinds of biomarkers were found：lactic acid， 3-hydroxy-butyric acid， glycine， serine， lysine， dextrose， arachidonic acid and other metabolites. Conclusion Expressions of biomarkers， such as lactic acid and glycine， are energy metabolism， immune function， and inflammation， which provide material basis for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome.
Key words：GC-MS；blood；Xiaoqinglong Decoction Syndrome；rats
小青龙汤首见于《伤寒论·辨太阳病脉证并治》“伤寒表不解，心下有水气，干呕，发热而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利，少腹满，或喘者，小青龙汤主之”。全方共8味药，是张仲景治疗外寒内饮证的名方。
基金项目：国家自然科学基金（81102538）；山西中医学院临床基础项目（2011JC05）
通讯作者：何丽清，E-mail：hlqyx@163.com
小青龙汤证为外感风寒表邪、内有水饮之气、内外合邪而表现出的适合服用小青龙汤的症状，其临床表现较多，其中咳嗽、痰多、喘息为小青龙汤证辨证关键。尽管对小青龙汤已有较多研究，但对其证本质研究仍有不足。目前，气相色谱-质谱（GC-MS）技术较为成熟地运用于中医证候客观化研究，且在证候动物模型证本质研究中取得一定进展，代谢组学与生理学的联系更加紧密[1-2]。本研究采用GC-MS测定大鼠血液中内源性代谢物，为小青龙证证本质研究提供基础。
1 仪器、试药与动物
气相色谱-质谱联用仪（Trace GC-PolarisQ Mass， Thermo Finnigan），DZF-1B型真空干燥箱（上海跃进医疗医械厂），TGL-6高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司），KQ2200型数控超声仪（昆山超声仪器有限公司），ESJ120-4电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。
N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺[MSTFA，含1%TMCS（三甲基氯硅烷）]，美国Thermo pierce公司；吡啶、甲氧胺盐酸盐、正庚烷、乙腈均为分析纯，北京化工试剂公司；二十四烷，上海索莱宝生物科技有限公司。
内标液：精密称取1 mg二十四烷，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，即得0.1 mg/mL二十四烷内标工作液。
Wistar大鼠，雄性，体质量（200±10）g，清洁级，中国医学科学院中国协和医科大学动物研究所提供，合格证号SCXK（京）2009-2004。
2 方法
2.1 动物分组、造模与取样
将36只Wistar大鼠随机分为空白对照组10只、模型组13只和小青龙汤组13只，饲养于普通级动物房。依据外感风寒表邪、内有水饮之气，内外合邪病机制作外寒内饮（小青龙汤证）模型：将模型组和小青龙汤组大鼠放置于寒冷环境（控制室内温度在10 ℃左右）中喂养，每日在低温环境[（0±4）℃]冷冻1 h，并放入冰水中游泳，水面淹没大鼠鼻尖时将大鼠捞出，持续4周，同时进寒凉饮食（冷冻饲料及冰水）。空白对照组不做任何处理。小青龙汤组大鼠给予小青龙汤（麻黄9 g，白芍9 g，细辛3 g，干姜3 g，炙甘草9 g，桂枝9 g，五味子9 g，姜半夏9 g，山西中医学院第二附属医院药房提供）灌胃，连续15 d。将3组大鼠麻醉后腹主动脉取血，存放在-80 ℃冰箱中[4]。
2.2 生物样品制备
从-80 ℃冰箱中取出血液，解冻，摇匀，取上清液100 µL，加入250 µL乙腈，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液150 µL，氮气吹干，加入30 µL甲氧胺（15 mg/mL）吡啶溶液，70 ℃反应1 h。加入50 µL MSTFA，40 ℃反应90 min。加入500 µL正庚烷（0.1 mg/mL二十四烷），涡旋1 min，进行GC-MS分析。
2.3 气相色谱-质谱条件
进样量：1 µL；进样口温度：260 ℃；离子源温度：200 ℃；载气：氦气；载气流速：1 mL/min；DB-5MS毛细管柱；不分流进样。质谱检测条件：电离方式EI，电子能量70 eV，全扫描模式，50～650 m/z。程序升温：起始温度60 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升至140 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，保持6 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。
2.4 模式识别分析与统计方法
运用SIMCA-P+软件进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和建立模型，采用SPSS17.0统计软件对截荷图远端标记物进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 血液样品测定结果
3组血液样品GC-MS测定所得色谱图见图1。各色谱峰分布均匀，峰形较好，且得到很好的分离，模型组和空白对照组直观可见较多差异峰，如15.11、15.80、27.67、33.17、41.25。说明大鼠造模后体内代谢物发生了明显变化。
3.2 多元统计分析
分别对空白对照组与模型组、小青龙组与空白对照组血液样本GC-MS数据进行分析，PLS-DA分析结果见图2。
从散点图可以看出，空白对照、模型组分布在t[1]轴两侧，直观反映了空白对照组与模型组之间有差别，说明造模之后机体的代谢物发生了变化。小青龙汤组接近空白对照组，反映了模型大鼠在服用小青龙汤之后，代谢物明显接近空白对照组。结合载荷图、典型的血液图谱及SPSS软件分析结果得到这些生物标志物：乳酸、甘氨酸、丁二酸、丝氨酸、赖氨酸、缬氨酸、吡喃半乳糖苷、山梨醇、葡萄糖、花生四烯酸等。以上这些代谢物在用药后发生明显变化。
从3组载荷图结合VIP值（variable importance in the projection，变量重要性投影，可以预测各个数据对模型的贡献值，VIP>1的意义在于可能为潜在标志物）寻找导致其分开的差异性成分，即小分子标志物，结果共找到13个标志物，见表1。采用SPSS17.0统计软件对13个标志物进行t检验，部分结果见表2。
4 讨论
由于GC-MS在具有诸多优点同时，也有不能分析大分子、难挥发性和热不稳定性物质的缺点，所以，在处理血液样本同时需要对样本进行衍生化处理。三甲基硅烷（TMS）衍生化在样本硅烷化处理的基础上进行GC-MS检测，结合PLS-DA有监督的模式识别方法，能够对样本进行较好的分析，有利于寻找内源性代谢物的小分子标记物。所以参考文献[5-7]，本试验选择TMS衍生化试剂对血样进行处理。
血液中的主要代谢产物为氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类等，且与机体内多种代谢途径密切相关。在机体内，任何疾病的发生都会引起其内源性物质发生变化。本研究采用GC-MS技术分析血液中发生显著变化的代谢物，说明引起小青龙汤证整体代谢变化的情况，寻找小分子标记物，进一步探讨小青龙汤证证本质。
其中乳酸在模型组中大量堆积（较空白对照组显著升高，P<0.01，见表2），造成酸痛、倦怠、发冷、疼痛等。说明模型组机体出现能量代谢异常，解释了模型组中动物在寒邪上受首先犯肺而出现的机体应激发应。尿素是了解肾脏机能的重要指标，在模型组的血液中尿素升高，说明机体内有毒的含氮代谢物增加，又由于尿素在蛋白质和氨基酸分解过程中，其升高进一步说明模型组的代谢异常，解释了模型组中动物由于水液代谢障碍，出现的尿量减少、水肿症状。葡萄糖、吡喃半乳糖苷较空白对照组下降，3-羟基丁酸较空白对照组升高，均说明模型组能量代谢异常。丝氨酸、赖氨酸均能提高机体免疫力的氨基酸，模型组较空白对照组显著下降，说明模型组机体的免疫力下降，机体在感受寒邪后，正气抗邪于外，能量代谢增加，而表现出倦怠等。另外，血液中的花生四烯酸是白三烯的前体，白三烯与支气管哮喘、慢性支气管炎的炎症有密切关系[8-10]。模型组中花生四烯酸明显升高（与空白对照组比较，P<0.05，见表2），说明机体内有明显炎症，小青龙汤组较空白对照组标记物均有不同程度的回调，说明小青龙汤证与炎症、免疫相关。
核磁共振技术与GC-MS技术同属于代谢组学研究中的两大技术。本课题组前期研究中，基于核磁共振技术检测到了肌酸、乳酸、3-羟基丁酸、天冬氨酸、牛磺酸等十几种代谢物，数目较少，这与其灵敏度较低、分辨率不高的缺点有关。相对于核磁共振技术，GC-MS技术检测到了乳酸、3-羟基丁酸、甘氨酸等30多种代谢物，源于其高灵敏度、高分辨率、高通量等优势。单纯氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸等8种。
前期研究中，基于核磁共振技术检测血液找到的小分子标志物反映小青龙汤证主要与能量代谢、免疫功能、机体应激方面有关[4]。本次基于GC-MS的研究结果，即小青龙汤证证本质与能量代谢、炎症反应、免疫相关，与前期结果较为一致。另外，本研究在血液检测中找到了与炎症相关的标记物花生四烯酸，与免疫功能相关的丝氨酸、酪氨酸，与能量代谢相关的葡萄糖、吡喃葡萄糖等代谢物，更加说明了小青龙汤证的本质所在。
本研究结果从另外一方面对整体代谢上小青龙汤证证本质进行了剖析与探究。为了更好地应用GC-MS这一检测手段，综合分析小青龙汤证，找出其本质的小分子标记物，我们将继续用以分析肝、肾、肺组织，并动态分析尿液，以更加全面阐释小青龙汤证。
本研究验证了GC-MS技术这一高通量、高灵敏的分析手段结合PLS-DA模式识别用于证本质研究的可行性，基于机体整体功能性变化检测方法与中医的整体理论相结合，通过检测机体内源性差异代谢物，研究机体代谢途径，用以区分疾病模型和正常个体，建立疾病经典指标与代谢组学中生物标志物的关系，从而为证候本质研究提供依据。
参考文献：
[1] 刘晓鹰，罗接红.代谢组学技术在中医证候动物模型研究中的进展[J].湖北中医杂志，2012，34（11）：33-36.
[2] 高扬，张安晶，胡元会.代谢组学在中医证候研究中的应用进展[J].中国中医基础医学杂志，2013，19（6）：710-712.
[3] 赵龙山，李清，郭超伟，等.质谱联用技术在生物样品分析中的应用[J].药学学报，2012，47（2）：158−162.
[4] 盖江华，何丽清，郭鑫.基于核磁共振技术的小青龙汤证的证本质研究[J].世界中西医结合杂志，2013，8（3）：230-233.
[5] 夏鑫华，刘梅，李欢.基于衍生化反应和GC-MS技术测定大鼠血液和尿液中内源性代谢物轮廓谱[J].中华中医药学刊，2012，30（1）：41-43.
[6] 崔杰，郑兴宇，高晓霞，等.逍遥散抗抑郁作用最佳剂量筛选[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（13）：57-59
[7] 林景超.化学性肝损伤及肝癌的代谢组学研究[D].上海：上海交通大学，2008.
[8] 欧阳金生，刘少滨，黄绍光.慢性支气管炎大鼠模型白三烯B4水平的变化[J].中华结核和呼吸杂志，2006，29（5）：343-344.
[9] 刘芳英，申燕华，钱叶长.白三烯调节剂在支气管哮喘药物治疗中的研究进展[J].临床荟萃，2013，26（8）：947-950.
[10] 方芬，谭毅.咳嗽变异性哮喘与白三烯关系的研究进展[J].中国临床新医学，2013，6（1）：87-90.
（收稿日期：2014-06-29；编辑：陈静）