脑内同步灌流NaN3致大鼠mPFC和海马细胞外液中胆碱类递质含量变化

材料

1.1 动物 SD大鼠12只，雄性，体重250～280 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。实验环境室温度16～20 ℃，相对湿度为40%～55%，12 h光照周期（7：00至19：00照明）。

1.2 药品和试剂 氯化乙酰胆碱（货号A6625-25G），氯化胆碱（货号C7017-5G），新斯的明（货号C7017-5G），氯化钾（货号P9541），HPLC Grade，防腐剂 ProClin95（货号46878-U），以上产品均购自Sigma公司。乙腈和甲醇为Fisher Chemicals公司产品（HPLC级）。水合三氯乙醛（批号20111024），氯化钠（批号20120413），氯化钙（批号F20111116），氯化镁（批号20100830），磷酸氢二钠（批号20080116），磷酸二氢钾（批号20071225），碳酸氢钠（批号20120508），氢氧化钠，磷酸二氢钠，Na2·EDTA·2H2O 均为国药集团化学试剂有限公司产品。

1.3 仪器 液相检测系统包括高效液相色谱，Antec Decade ⅡSDC电化学检测器，铂金工作电极，银/氯化银参比电极，Clarity Lite 色谱工作站，荷兰Antecleyden公司出产。Microbore column ACh/Ch analytical column（165G-007A， 530×1 mm），AChE/ChOX×IMER（191-H03，50×1 mm），均由美国BASi公司提供。SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；德国Sartorius arium 61316反渗透纯水系统；德国Sartorius PB-21 pH计；天津津腾水相和有机相微孔滤膜。手术使用设备：立体定位仪STRONG8003，动物体温维持仪-69001，颅钻/90-102，均购自深圳瑞沃德公司。玻璃离子体水门汀（批号201312，上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂）。微透析系统包括CMA/12 MD Elite Probe（Menb length： 4 mm，Menb O.D. 0.5 mm，Cut-off： 20 000 Da； Menb length： 2 mm，Menb O.D. 0.5 mm，Cut-off： 20 000 Da）及探针套管，CMA/402微量注射泵，CMA/470低温样品自动收集器，均购自瑞典CMA Microd AB；五通转环清醒活动装置（美国InsteCh公司）。

2 方法

2.1 动物分组、脑双位点套管植入术 大鼠自由进食和饮水，适应性饲养 3 d，体重为280～320 g。随机分为正常对照组（C组）和模型组（M组），每组6只。分别进行脑双位点套管植入术。水合氯醛（350 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉。大鼠固定于立体定位仪，在脑mPFC（A：+3.2 mm，R：-1.5 mm，V：-2.0 mm，与矢状面成10°的夹角）和海马（A：-5.6 mm，R：+4.6 mm，V：-3.4 mm）埋入探针套管，用玻璃离子体水门汀固定。

2.2 双通道同步透析取样 术后次日，大鼠在清醒状态下插入探针，其中将膜长2 mm探针插入mPFC位点套管中，将 4 mm探针插入于海马套管中。固定好2个探针后，大鼠放在清醒活动装置内让其自由活动。微透析方案如下：2条通道均用改良的Ringer氏液（含新斯的明2 μmol·L^-1，N-Ringer）以1.5 μL·min^-1进行同步灌流。平衡2 h后，开始收集透析液，每20 min收集1管。其中C组一直用N-Ringer灌流透析，共收集540 min。M组用N-Ringer平衡2 h后，开始收集透析液80 min，作为基础水平值。改用含NaN3的Ringer氏液（含NaN3 50 μmol·L^-1和新斯的明2 μmol·L^-1）灌流120 min，然后再换为N-Ringer灌流340 min。

2.3 高效液相-酶柱-电化学法（HPLC-IMER-ED）色谱分析透析液中ACh和Ch 色谱分析条件：等梯度洗脱的流动相组成为：50 mmol·L^-1的NaH2PO4·2H2O，0.5 mmol·L^-1的 Na2·EDTA·2H2O，2 mmol·L^-1的KCl，9.5%ProClin 1 mL·L^-1，用NaOH调节pH为8.3，用0.22 μm滤膜过滤。流速0.13 mL·min^-1。参考电极的电位设置为+310 mV。柱温和电极工作室温为37 ℃，进样量为20 μL。依次检测奇数管号中透析液。

2.4 探针体外回收率测定 不同膜长探针分别放置于2 mix（Ach和Ch）的标准溶液中，室温37 ℃，用N-Ringer以 1.5 μL·min^-1灌流，平衡30 min后，开始收集透析液，每20 min为1管，共4管。Ach（或Ch）探针体外回收率=（4管透析液的浓度均值/标准放置液中的浓度均值）×100%。

2.5 数据处理 测定 1，3 管透析液中Ach（或Ch）数值，取平均数作为基础值，设定基础值采集时间点为0 min。计量资料采用±s表示，SPSS 17.0统计软件处理，组间比较采用 Independent-Samples t test，自身前后对照采用重复测量分析方法分析，P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 正常大鼠mPFC和海马细胞外液中ACh含量 C组大鼠mPFC细胞外液中ACh含量在 40～80 min明显高于海马（P<0.05），在120～480 min mPFC中ACh具有高于海马的趋势。说明正常大鼠mPFC中ACh含量高于海马区。mPFC细胞外液中ACh随着采集时间推移，在 200，360～440 min的4个时间点含量低于基础状态值（P<0.05）。同样，海马细胞外液中ACh随时间推移也显著低于基础值（120～480 min，P<0.01或P<0.001），海马中ACh含量变化范围较大（表1）。

3.2 NaN3对大鼠mPFC和海马细胞外液中ACh的影响 与C组相比，M组大鼠mPFC细胞外液中ACh在灌流NaN3 40～80 min能显著降低（P<0.01）。随后逐渐恢复ACh含量。NaN3在80 min诱导海马区ACh明显下降（P<0.05），自120 min ACh开始恢复，与C组海马区ACh含量基本持平（图1）。

M组大鼠mPFC细胞外液中ACh含量在NaN3灌流40～160 min能显著降低（P<0.001或P<0.05），在灌流结束后360～480 min的4个时间点均显著减少（P<0.001）。同样，海马细胞外液中ACh在NaN3灌流和之后40～480 min均能显著降低（P<0.001）。说明NaN3灌流期间能导致mPFC和海马细胞外液中ACh含量显著降低，其后期抑制效应也持续存在（表2）。

3.3 正常大鼠mPFC和海马细胞外液中Ch含量 C组大鼠mPFC细胞外液中Ch在0，240和320～480 min明显高于海马（P<0.05或P<0.01）。说明正常大鼠mPFC中Ch含量高于海马区。mPFC细胞外液中Ch随着采集时间推移，在120～480 min明显低于基础状态值（P<0.001）。同样，海马细胞外液中Ch随时间推移也显著低于基础值（120～480 min，P<0.001）。说明mPFC和海马细胞外液

与C组相比1）P<0.05，2）P<0.01；A. mPFC；B.海马（图2同）。

图1 对大鼠mPFC和海马细胞外液中ACh的影响（±s，n=6）

Fig.1 The ACh of extracellular fluid in mPFC and hippocampus of C and M group rats （±s，n=6）

图2 对大鼠mPFC和海马细胞外液中Ch的影响（±s，n=6）

Fig.2 The Ch of extracellular fluid in mPFC and hippocampus of C and M group rats（±s，n=6）

M组大鼠mPFC细胞外液中Ch含量在NaN3灌流40～120 min能急速显著升高（P<0.01或 P<0.000 1）。同样，海马细胞外液中Ch在NaN3灌流期间及之后80～200 min均能显著升高（P<0.05 或P<0.001）。说明NaN3灌流能即可导致mPFC和海马细胞外液中Ch含量显著升高，灌流期间海马区影响明显高于mPFC；但灌流结束后均具有抑制Ch恢复的趋势，对mPFC中Ch的抑制作用明显大于海马区（表4）。

4 讨论

AD是一种进行性精神功能衰退性疾病。主要症状为进行性记忆力和认知力减退、言语障碍、精神运动异常等症状。AD包括与年龄相关的迟发型散发性AD和早发型遗传性AD。近期有学者提出散发性AD的发病机制可通过“线粒体级联假说”来解释。AD患者脑细胞中与线粒体氧化代谢有关的丙酮酸脱氢酶复合物及三羧酸循环中所有酶活性均降低，其中线粒体呼吸链复合体Ⅳ（即细胞色素C氧化酶cytochrome C oxidase， COX）的活性降低明显。脑切片中皮层及海马区COX Ⅳ亚单位的mRNA水平下降， 因此COX缺陷可能是AD的特异性改变^[1-2]。实际上，线粒体功能障碍是AD发病早期最

主要的特征，由于线粒体损伤，出现能量代谢障碍、活性氧的产生及钙稳态的失衡，从而诱发AD的发生。NaN3是特异性COX抑制剂，国内外均有报道^[5]使用NaN3皮下恒速灌注大鼠，导致ATP合成减少，动物脑内COX活性下降，引发学习记忆障碍。然而，COX缺陷可能是导致模型动物学习记忆障碍的机制尚未完全阐明。

胆碱能损伤学说是目前公认的AD发病机制之一^[1]。AD患者皮质的胆碱能系统发生了严重的溃变，引起老年性学习记忆减退和认知障碍。正常前脑的胆碱能神经元（基底核、斜角带核和内侧隔核）合成大量ACh，经投射纤维输送至大脑皮层和海马，mPFC参与注意、知觉和决策功能，而海马是学习记忆的重要解剖基础。ACh和Ch是中枢神经系统的重要递质。Ch既是ACh的代谢产物又是合成ACh的前体物质。ACh脑内水平的平衡调节对维持学习、记忆、注意力和探究行为等脑高级功能的正常运行非常关键。通过测定脑内ACh的含量可以较可靠的反映脑内胆碱能神经的功能。

本研究采用了BMD结合HPLC-IMER-ED方法，对NaN3导致的线粒体损伤AD模型的mPFC和海马细胞外液中ACh和Ch进行了动态监测分析。结果显示：正常状态下大鼠mPFC细胞外液中ACh和Ch均高于海马。NaN3在灌流期间能明显降低mPFC/海马细胞外液中ACh，但相反显著升高Ch，而其停止灌流后均有抑制mPFC/海马区ACh和Ch恢复的效应。有研究^[6]显示纹状体内灌流NaN390 min后该脑区细胞外液ACh水平较正常组持续下降，最低值在停止NaN3灌流后60 min时出现。而本研究显示NaN3在灌流40 min后mPFC和海马即明显降低ACh水平，其最低值是在灌流开始40～80 min。说明NaN3对纹状体的作用不如在mPFC和海马2区表现更敏感。这可能是由于mPFC和海马是脑内胆碱能神经投射的主要区域。应用NaN3对大鼠脑内进行灌流，可建立线粒体损伤而致ACh和Ch代谢紊乱的AD急性模型，可用于AD发病机制和药理学研究，为筛选能改善脑能量代谢物质的中药脑保护剂提供了方法学参考和药理学依据。

[参考文献]

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[3] Blass J P， Gibson G E. Cerebrometabolic aspects of delirium in relationship to dementia[J]. Dement Geriatr Cogn Disord，1999， 10（5）： 335.

[4] Smith T S， Bennett J P Jr. Mitochondrial toxins in models of neurodegenerative diseases. I： in vivo brain hydroxyl radical production during systemic MPTP treatment or following microdialysis infusion of methylpyridinium or azide ions[J]. Brain Res，1997， 765（2）： 183.

[5] Lalonde R， Joyal C C， Beaudin S. Effects of sodium azide on motor activity， motor coordination， and learning[J]. Pharmacol Biochem Behav，1997， 56（1）： 67.

[6] 王巍，孙晓芳，王丹巧，等. 建立脑内灌流叠氮钠所致的大鼠纹状体内细胞外液中乙酰胆碱水平下降的模型[J]. 中国药理学与毒理学杂志，2004， 18（4）：313.

Effect of synchronous perfusion of NaN3 in changes in content of

cholinergic neurotransmitter in medial prefrontal cortex and

hippocampal extra-cellular fluid

ZHANG Mei-yu， SUN Dan-dan， LIU Yang， CUI Yue， ZHAO Xiao-liang， ZHANG Ying， WANG Zhi-guo， WANG Dan-qiao（Medical Experimental Center， China Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of synchronous perfusion of specific respiratory chain complex IV inhibitor sodium azide （NaN3） in brain on rat ventromedial prefrontal cortex （mPFC） and acetylcholine （ACh） and choline （Ch） contents in hippocampal extra-cellular fluid， and establish the AD rat model induced by mitochondrial acute injury. Method： The synchronous dual-probe dual-channel brain microdialysis sampling technology was applied to synchronously perfuse modified Ringer′s solution containing NaN3 （50 μmol·L^-1） and neostigmine （2 μmol·L^-1） into mPFC and hippocampus of conscious， freely moving normal rats， and continuously collect dialysates from different encephalic areas. Dynamic contents of ACh and Ch were determined by high performance liquid chromatography-post-column immobilized enzyme reactor-electrochemical process. Result： ACh and Ch contents in mPFC extra-cellular fluid of normal rats were higher than that in hippocampus. During the process of perfusion， NaN3 could significantly reduce ACh in mPFC/hippocampal extra-cellular fluid， but remarkably increase Ch， and constantly inhibit the recovery of ACh and Ch contents in mPFC/hippocampus. Conclusion： The synchronous perfusion of NaN3 in rat mPFC and hippocampus can injure functions of the cholinergic nerve projection area， and cause the acute AD model with ACh and Ch metabolic disorders. This model can be used in pathogenetic and pharmacological studies.

[Key words] synchronous dual-probe brain microdialysis； sodium azide； acetylcholine； choline； ventromedial prefrontal cortex； hippocampus

doi：10.4268/cjcmm20140324

[责任编辑 张宁宁]

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