应用定量蛋白质组学对谷子干旱响应蛋白的研究
摘要：谷子是我国的传统优势作物，具有抗旱、耐瘠薄、高光效以及基因组小、生育期短等突出优势，受到国际遗传学界的高度重视，已迅速发展成为功能基因组研究新的候选模式作物。但目前在蛋白质水平上解析谷子干旱响应的研究还较少。本研究利用TMT（tandem mass tags）体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术，筛选并鉴定谷子干旱响应蛋白。研究发现谷子干旱响应差异蛋白主要参与胁迫响应、碳代谢、光合作用和蛋白合成等相关代谢途径。该研究对于深入解析谷子的抗旱机制，培育抗旱耐逆谷子新品种具有重要意义。
关键词：谷子；干旱胁迫；蛋白质组；GO分析
中图分类号：S515+Q51文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0001-08
Abstract Foxtail millet is the traditional dominant crop in China. It has many outstanding advantages including drought resistance， poor soil tolerance， high photosynthetic efficiency， small genome and short growth period. The international field of genetics has paid more attention to it. It has been rapidly developed as the new candidate mode crop to study functional genomes. But there were less studies on the drought response of foxtail millet from protein level analysis at present. In the study， the drought response proteins of foxtail mille were screened and indentified by TMT technology. The results found that differential proteins in drought response of foxtail mille mainly participated in related metabolic pathways including stress response， carbon metabolism， photosynthesis and protein synthesis. This study was of great significance to deeply analyzing drought resistance mechanism and breeding new varieties of foxtail millet with drought and adversity resistance.
Keywords Foxtail millet； Drought stress； Proteomics； Gene ontology （GO） analysis
谷子（Setaria italica L. Beauv.）又称粟，去壳后为小米，是起源于我国的传统优势作物，也是粮饲兼用作物，种植面积占世界的80%。谷子在我国各省区几乎都能种植，主产区为东北、华北及西北地区。在北方干旱省份仍是重要粮食作物，在一些地区甚至是首要栽培作物。谷子具有抗旱耐贫瘠的特点，其营养保健价值、国际竞争力和产量潜力均被重新认识[1，2]。谷子不仅在目前旱作生态农业中有重要作用，而且针对日益严重的水资源短缺，谷子还是重要的战略储备作物，在我国国民经济中具有重要地位。
谷子与玉米、高粱、甘蔗、珍珠粟、糜子、柳枝稷等禾谷类粮食、能源作物近缘，具有抗旱、耐瘠薄、高光效以及基因组小、生育期短等突出优势。但长期以来谷子未受到国际科学界的关注，其遗传学研究相对滞后[3]。进入21世纪以来，谷子因其独特的优势而逐步受到国际遗传学界的高度重视，迅速发展成为功能基因组研究新的候选模式作物[4]。随着2012年谷子基因组测序工作的完成及相关序列信息的释放，在传统研究的基础上，结合目前迅速发展的分子生物学及基因工程技术，使从基因组入手对谷子进行有目的、有针对性的品质、性状研究及相关机制的解析成为可能[3]。通过以谷子为模式作物开展功能基因研究，不仅可以弥补相关作物基因组复杂、植株高大和繁殖期过长的不足，还能为解决多年来难以解析的抗旱和C4光合作用的遗传分子机理提供崭新的机遇，而且可以为研究作物的驯化和改良、抗旱性的遗传机制、植物系统进化和应用价值基因的分离和克隆提供独特的视角和思路[1-5]。
谷子在响应干旱胁迫时，一些保守的抗逆基因以及相关的代谢途径均发挥重要的作用，其中包括LEA蛋白、脱水素、乙醇脱氢酶、脯氨酸、淀粉、蔗糖等物质的代谢积累[1，3]。另外ABA响应元件结合蛋白AREB、MYC/MYB、CBF、NAC以及WRKY等转录因子在谷子的抗旱信号转导途径中也起着非常重要的作用[3]。SiNAC和SiDREB2的表达能明显受到干旱、盐渍的诱导[6，7]。同时，SiNAC和SiWD40基因家族中很多成员都参与谷子非生物胁迫响应[8，9]。最近的研究发现，谷子中含有20个乙醛脱氢酶ALDH基因，其中SiALDH7B1、SiALDH12A1和SiALDH18B2的表达能明显地被渗透胁迫、低温、H2O2和ABA所诱导，将SiALDH2B2、SiALDH10A2、SiALDH5F1、SiALDH22A1和SiALDH3E2分别转化大肠杆菌（E. coli）后能明显提高其盐胁迫抗性。这些结果表明SiALDH蛋白对于提高谷子的胁迫抗性具有重要作用[10]。类受体蛋白激酶SiRLK35的表达明显地受到NaCl和PEG处理的诱导。在原核菌株中诱导表达SiRLK35能明显增强菌株对盐胁迫的抗性，而且在水稻中过表达SiRLK35能明显增强转基因水稻的抗盐性[11-13]。通過对干旱胁迫后的谷子转录组深度测序分析，发现了大量差异表达的基因，其中24-nt siRNA对干旱响应基因的表达具有重要的调控作用，一些长链非编码RNAs（long noncoding RNAs， lncRNAs）也参与干旱胁迫响应[14]。对谷子基因组序列分析发现，谷子中含有1 517个特异的基因家族，这些基因家族中很多都与胁迫响应相关。其中一个包含586个成员的基因家族与水分胁迫相关，推测这些特异基因可能对于谷子的干旱耐性及抗性具有决定性的作用[3]。因此，筛选并研究谷子抗逆基因，尤其是抗旱相关基因已成为目前的研究热点。
TMT（tandem mass tags）技术是一种体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术，分别通过与氨基酸末端氨基以及赖氨酸残基的游离氨基结合，实现对多肽的标记，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多个样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术[15，16]。本研究利用TMT技术筛选参与谷子干旱胁迫响应的蛋白，对于深入解析谷子的抗旱机制，进一步指导谷子耐旱抗逆新品种的培育具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 谷子干旱处理
以谷子测序品种“豫谷1号”为材料，种子精选后，播种于花盆中，每个花盆装3 kg营养土和沙子（其中营养土和沙子的比例是1∶1），在溫室中培养，光周期为14 h，温度为30/25℃（日/夜）。正常生长3周后，通过控制土壤含水量进行干旱处理，其中对照组含水量控制在60%～70%，干旱组含水量控制在20%～30%，每个处理做2个重复。经干旱处理2周后取材，材料经液氮迅速冷冻，保存-80℃超低温冰箱备用。
1.2 利用TMT技术筛选参与谷子干旱响应蛋白
与杭州景杰生物科技有限公司进行合作，进行了蛋白质组的相关试验及数据分析，结合GO注释（包括细胞组成、分子功能、生物过程）、蛋白结构域注释、代谢通路注释以及亚细胞结构定位分析，对筛选出的差异蛋白进行分析及归类。
2 结果与分析
2.1 MS数据的质量控制
首先对质谱数据进行有效性分析，结果如图1A所示，鉴定到的所有蛋白分子量偏差主要集中在0附近，绝大多数都小于0.02 D，说明质谱数据符合要求。多肽的长度主要集中在8～16之间（图1B），这与胰蛋白酶分解成的肽段相符合，说明样品制备达到了标准。
2.2 数据分析
在谷子干旱后的质谱数据中共鉴定到4 074个蛋白点，其中有2 474个蛋白可进行定量分析，相对表达量超过1.5定义为上调蛋白，相对表达量低于1/1.5（0.67）定为下调蛋白，其中上调蛋白有252个，下调蛋白有69个，表达变化明显的总共有321个蛋白。
2.3 蛋白功能富集分析
对差异表达蛋白结合功能注释，进行功能富集分析，对谷子响应干旱胁迫的蛋白进行功能划分。在差异表达蛋白的功能富集分析中，应用费歇尔确切检验法进行了定义：如果假设检验值P﹤0.05，那么认为该蛋白是显著富集的。
2.3.1 Gene ontology （GO）富集分析 在GO富集分析中，首先，我们可以统计出显著差异表达蛋白在每个GO分类上的数量a和所有鉴定到的蛋白在每个GO分类上的数量b。然后统计出在GO分类注释中所有显著差异表达的数c，以及所有鉴定到的蛋白数d。最后，我们根据这四个数值（a， b， c， d）去计算费歇尔确切检验P值和富集倍数Fold eichment=（a/c）/（b/d）。如图2所示，在GO富集分析中，biological process中主要富集在metabolic process 和cellular process这两类中，cellular component中主要富集在membrane-enclosed lumen、organelle、macromolecular complex和cell这四类中，而 molecular function中主要富集在structural molecule activity这类中。
2.3.2 聚类分析 为进一步挖掘谷子经干旱胁迫后的蛋白数据变化情况，基于蛋白功能富集分析又进一步进行了聚类分析，在biological process中，上调的蛋白主要聚类在cellular metabolic process、response to stress和biosynthetic process等（图3）。聚类在cellular metabolic process的蛋白主要参与光合作用、碳代谢和蛋白合成等过程。聚类在response to stress中的蛋白主要包括abscisic stress-ripening protein （ASR）、non-specific lipid-transfer protein （nsTLP）、抗氧化还原酶蛋白、Hsp蛋白等。聚类在biosynthetic process中的主要包括蛋白合成相关的蛋白如核糖体蛋白、转录因子等，ATP合酶蛋白、多胺合成酶蛋白、氨基酸合成相关蛋白、脯氨酸合成酶蛋白等。
在cellular component中，上调的蛋白主要聚类在cell part、ribosome、plasma membrane等（图4）。聚类在plasma membrane的蛋白主要包括胁迫响应蛋白、碳代谢相关蛋白等。下调的蛋白主要聚类在photosystem Ⅰ，如photosystem Ⅰ reaction center subunit和thylakoid membrane phosphoprotein。
在molecular function中，上调的蛋白主要聚类在catalytic activity、structural molecule activity和coenzyme binding等（图5），聚类在catalytic activity的蛋白主要包括胁迫相关的抗氧化酶类、光合作用和碳代谢过程中的催化酶类以及各种代谢相关的酶类。聚类在structural molecule activity的蛋白主要包括核糖体小亚基蛋白和微管蛋白。
2.3.3 KEGG代谢途径分析 在KEGG分析中，我们首先计算每个途径中表达变化的蛋白数（a）和该途径中的所有可定量的总蛋白数（b），然后统计在KEGG途径中所有表达变化的蛋白数（c）和所有可定量的蛋白数（d）。最后，结合这四个数值（a， b， c， d）去计算费歇尔确切检验P值和富集倍数Fold eichment=（a/c）/ （b/d）。结果如图6所示，表达上调的蛋白主要富集在carbon fixation in photosynthetic organisms、ribosome、carbon metabolism、protein processing in endoplasmic reticulum、pyruvate metabolism、glyoxylate and dicarboxylate metabolism、photosynthesis-antenna proteins、glycolysis/gluconeogenesis、biosynthesis of amino acids 和tryptophan metabolism。下调蛋白主要富集在phenylalanine metabolism、phenylpropanoid biosynthesis、photosynthesis、metabolic pathways和oxidative phosphorylation。
2.3.4 蛋白结构域功能富集分析 蛋白结构域功能富集分析方法与GO富集分析方法相同。如图7所示，上调表达的蛋白主要富集在NAD（P）-binding domain、alpha crystallin/Hsp20 domain、Hsp20-like chaperone、Thioredoxin-like fold、Thioredoxin domain等，下调表达的蛋白主要富集在Heat shock protein DnaJ、cysteine-rich domain。
3 讨论
近年來，随着全球气温的升高和淡水资源的匮乏，现代农业的发展对作物品种提出了更高的要求，培育耐旱、耐瘠薄的作物新品种，不仅有利于旱作农业的发展，还可以减少化肥用量，对生态环境的可持续发展具有重要意义。谷子作为我国的传统优势作物，具有抗旱、耐贫瘠和高光效等突出优势，谷子特殊的生理特点：叶面积小、细胞壁较厚、根系发达都赋予谷子突出的水分利用效率和耐逆性[17]。2012年谷子基因组公布后，作为一种新兴的模式作物，谷子逐渐被国内外的专家学者所接受。利用转录组学、生物信息学等手段，谷子抗逆、发育相关的基因被大量挖掘出来，但相关数据还是很有限，而本实验室利用TMT蛋白定量分析方法解析了谷子经干旱胁迫后的蛋白组学变化，分析了参与谷子干旱响应的蛋白，具有重要的意义。
本研究共鉴定到差异蛋白321个，其中上调的蛋白252个，下调的69个，通过生物信息学分析发现这些表达变化的蛋白参与细胞代谢的各个途径。其中包括一些胁迫响应蛋白如late embryogenesis abundant （LEA） protein、heat shock protein（Hsp），这些蛋白的积累能有效保护细胞的正常代谢，Hsp作为分子伴侣促进蛋白的正常折叠。植物在受到胁迫后会产生大量的ROS，抗氧化酶能有效地清除多余的ROS，谷子在受到干旱胁迫后POD、SOD、CAT、APX和GST等抗氧化酶蛋白明显增加，有助于清除ROS，避免了过量ROS积累对植物造成的危害。植物在响应胁迫过程中，需要启动一系列的响应反应和代谢变化，因此这个过程中需要消耗大量的能量，在本研究结果中也发现了大量与能量代谢相关的蛋白有明显的积累，其中光合作用碳固定过程、糖酵解、三羧酸循环和呼吸链上相关的催化酶和蛋白都有所增加，这些蛋白的积累能有效地增强胞内的能量代谢，为谷子胁迫响应提供充足的能量。参与代谢合成过程的催化酶和合成酶蛋白也有不同程度的积累，包括脯氨酸、甜菜碱、胼胝质合成酶、脂肪酸、氨基酸、脂质代谢相关酶类等。这些物质的积累与代谢都对增强植物对干旱胁迫的响应及抗性具有重要作用。
本研究在分析谷子干旱响应蛋白质组学的基础上，将进一步解析关键胁迫响应因子，克隆抗旱相关的基因，通过转基因技术结合生理生化分析，对基因的功能及作用机制进行解析，为作物新品种培育及旱作农业的可持续发展提供基因资源和理论基础。
参 考 文 献：
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