急性不同强度至力竭运动对大鼠肝细胞凋亡的影响

基金项目：湖南省2003年自然科学基金资助课题(29040214)

作者简介：李善妮(1969-)，女，湖南邵东人，讲师，硕士，研究方向运动医学。摘 要：研究方法：将成年雄性SD大鼠30只随机分为对照组、中等强度至力竭运动组和大强度至力竭运动组。测定肝线粒体中的Ca²⁺含量，观察凋亡肝细胞核，以探寻运动与肝细胞凋亡的相关性。研究结果：1)对照组的肝细胞中检测到少量TUNEL阳性细胞核，ME组、HE组出现凋亡细胞核；运动组与安静组相比，差异显著(P＜0．05)，并且不同强度组组间的差异显著(P＜0．05)；2)HE染色显示运动组肝细胞明显肿胀，肝窦变窄甚至消失，核变小，深染，肝小叶轮廓改变。3)中等强度力竭性运动后，肝线粒体钙含量比对照组增加263％，差异非常显著(P＜0．01)。运动组线粒体钙含量有大量的增加，与对照组相比差异具有显著性意义，不同强度组间的差异显著(P＜0．05)。结论：线粒体内Ca²⁺的大量积聚可能激活了细胞凋亡的启动程序，这使得中等强度力竭运动更易于导致肝细胞凋亡。

关键词：细胞凋亡；运动；肝细胞；线粒体钙离子

中图分类号：G804．23　文献标识码：A　文章编号：1007-3612(2006)05-0634-03

观察急性力竭运动后肝细胞凋亡现象，以此来探讨运动对肝细胞凋亡的影响，寻求运动与肝细胞凋亡的相关性，探讨肝细胞凋亡与运动损伤、运动性疲劳的关系，为科学训练提供实验依据。

1　研究对象与方法

1．1　研究对象　成年雄性SD大鼠30只，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。体重219．2±19．5g，分笼饲养，自由饮食，国家标准啮齿类动物饲料饲养(中南大学湘雅医学院动物学部提供)。室温20～℃24光照时间为7：00～19：00。

1．1．1　运动方式　将30只大鼠随机分为对照(C，n＝10)和运动实验(E，n＝20)两大组，运动实验组又分为中等强度至力竭运动组(ME，n＝10)和大强度至力竭运动组(HE，n＝10)。实验前所有动物均未进行过运动训练。大鼠进行3 d的运动跑台适应(速度为10 m／min，时间为10 min／d，坡度为0‘)。正式实验时，跑台坡度为10°，运动强度依据Bedford所建立的运动负荷模型，中等强度运动组以19．3 m／min(相当于76％VO_2max)的速度运动至力竭，大强度运动组以26．8 ndmin(相当于92．3％V0_2max)的速度运动至力竭。

1．12　力竭标准　到运动末期，动物未能坚持原跑速，先后滞跑道后1／3处达3次以上，刺激驱赶无效，停跑后体征表现为呼吸急促，神情倦怠，腹卧位，对刺激反应迟钝。

1．1．3　标本制备　对照组与运动组大鼠分别于安静状态和运动后即刻断头处死，取肝左侧叶，一部分用于电镜观察，一部分投入3．7％的福尔马林缓冲固定液中固定4～8h后进行常规石蜡包埋。取样本0．2s左右，剪碎后按1：9的比例加入9％的冰生理盐水，用电动匀浆机在冰水浴中进行匀浆，匀浆液3 500·r／min离心10min，提取上清液，即制备10％组织匀浆液。

1．2　指标检测

1．2．1　细胞凋亡检测　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)进行细胞凋亡检测，TUNEL试剂盒产自德国R&D公司，购于深圳晶美生物工程公司。

1．2．2　HE染色　5lan厚的石蜡肝左侧叶组织横切片常规脱蜡入水后用HE染色法进行染色，细胞核染成蓝色，胞质染成红色，观察肝细胞的整体结构。

1．2．3　线粒体钙离子的测定　取10％的组织匀浆液0．2 mL以8 000—10 000r／min离心15 min，弃上清，取沉淀加入冰生理盐水，制成线粒体悬液，用比色法测定线粒体钙离子浓度。试剂盒均购自南京建成生物工程技术公司。测定仪器：722型光栅分光光度计。

1．3　质量控制　1)实验中所用玻璃仪器先全部用洗涤液刷洗后，用重铬酸钾洗液浸泡24 h以上，用清水冲洗后，再用蒸馏水润洗3次。但是测量钙离子时所用的器皿必须用10％硝酸溶液清洗，再用去离子水润洗3次。2)运动时用声音刺激或小木棍刺激动物尾部，必要时采用一定的电刺激，使其保持在跑道前1／3处，以确保运动强度。3)本次实验必须及时测定，每份样品测两次，相对误差必须小于20％，否则重测。

1．4　统计学分析　组间差异采用方差分析法，并使用图凯法(tukey)进行多重比较，显著性水平为a：0．05。所有数据均使用SPSSl0．0软件进行分析。

2　实验结果

2．1　大鼠运动情况　运动组的20只大鼠都较好地完成了运动，整个运动过程中基本未出现拒跑的现象，中等强度运动组的力竭运动时间为234．6±60．05 min，大强度运动组的力竭运动时间为92．4±34．61 min。

2．2　肝细胞凋亡及组织学改变

2．2．1　TUNEL阳性标记细胞核结果 细胞凋亡时，DNA双键断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’—OH末端，就可在TdT的作用下，将脱氧核糖核苷酸和HRP形成的衍生物标记到DNA的3’—末端，该物质与DAB发生显色反应，使凋亡的细胞核呈现出棕色，而正常的细胞核会被甲基绿复染为绿色(图1)。每张切片光镜(40x15倍)观察10x500个细胞，计算每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数(Apoptosislndex，A1)。TUNEL标记切片用NikonE600显微照相图像采集系统进行照相。

使用TUNEL法对凋亡细胞核进行标记，结果(表．1)可知在对照组中，肝细胞未检测到TUNEL阳染细胞核；中等强度力竭运动后即刻出现了散在的TUNEL阳染细胞核，凋亡指数为(33．40±8．38％)；大强度力竭运动后即刻肝细胞中检测到细胞凋亡，凋亡指数为(13．50±3．81％)；运动组与对照组差异显著(p＜0．05)，不同强度运动组组间的差异显著(p＜0．05)。

2．2．2　HE染色结果　对肝组织横切片进行HE染色的结果发现，对照组大鼠肝细胞结构完整，肝索清楚，核大，呈圆形。但经过力竭运动后，中等强度至力竭组和大强度至力竭组肝细胞明显肿胀，肝窦变窄甚至消失，核变小，深染，汇管区及小叶间血管扩张淤血，并见肝小叶轮廓改变等病理性变化，随着疲劳程度的加深。其中中等强度至力竭运动组变化明显于大强度至力竭运动组(图2)。

2．3　肝细胞线粒体Ca含量 结果显示，两种强度的力竭运动后，肝细胞中ca^2＋含量都显著增加了，中等强度至力竭运动后，

肝细胞中Ca^2＋含量比对照组增加了804％，差异显著(p＜0．05)；大强度至力竭运动后，肝细胞中Ca^2＋含量增加了287％，差异显著(p＜0．05)，同时不同运动组组间之间差异显著(p＜0．05)。

3　讨论

3．1　运动对大鼠肝细胞凋亡的影响　运动能否造成肝细胞凋亡，近年已成为运动医学研究热点。本研究发现：随着运动时间的延长，细胞凋亡数增多。中等强度组的细胞凋亡数比大强度组细胞凋亡明显。原因可能是随着运动时间的延长，肝出现缺血再灌注，加重了肝的功能障碍和结构损伤。缺血再灌注损伤的严重程度关键在于缺血时间的长短、侧支循环的形成情况、对缺氧的需求程度以及电解质浓度。在实验中，中等强度运动组的力竭运动时间为(234．6±60．05)min，大强度运动组的力竭运动时间为(92．4±34．61)min。说明了运动组均产生了肝缺血再灌注损伤。同时由于中等强度力竭运动组的运动时间是大强度运动组力竭时间的2．5倍，故结果显示中等强度力竭运动组更易于凋亡，其凋亡程度与运动时间相关。肝缺血再灌注损伤原因可能主要是能量代谢障碍，氧化磷酸化脱偶联，高能磷酸化合物缺乏、氧自由基增多有关。

3．2　线粒体Ca^2＋含量与肝细胞凋亡的关系 在生理情况下，Ca^2＋作为细胞内第二信使，在维持细胞增殖、分裂、运动、能量代谢、氧代谢、Ca^2＋依赖蛋白激酶和磷脂酶的激活等方面发挥着重要作用^[1-3]。国内外不少专家学者对Ca^2＋浓度与细胞凋亡的关系有争议。zhou等认为细胞内游离钙浓度升高诱导细胞凋亡^[4-]。Kono等发现细胞内游离钙浓度的升高抑制细胞调亡”^[7-9]。

本研究发现，经过急性力竭运动后，大鼠肝线粒体的Ca^2＋浓度都上升了，其中中等强度力竭运动后线粒体Ca^2＋浓度增加具有显著意义，这似乎表明线粒体聚钙与细胞凋亡之间存在着某种联系。本研究的结果可以推出如下假设：长时间的力竭运动导致缺氧，损伤线粒体结构和功能，胞内ATP合成减少，胞膜受损，跨膜ca^2＋内流增加，内质网等胞内钙库释放Ca^2＋增多，胞膜Ca^2＋泵排Ca^2＋能力和内质网膜Ca^2＋-Mg^2＋-ATP酶摄Ca^2＋能力下降，Cs^2＋滞留于胞内^[9]。氧化性应激使胞内GSH／GSSH比值下降，引起胞膜Cs^2＋通道蛋白变构，Ca^2＋内流增加，内质网Ca^2＋通道蛋白功能性巯基结构改变，Ca^2＋大量异常释放，胞内Ca^2＋重新分布。细胞内钙离子浓度升高，线粒体为了维持细胞内正常的钙离子浓度而摄钙作用加强，最初这种摄钙作用可以减缓胞内钙离子的急剧上升对细胞所造成的损伤，但是当线粒体钙离子过载时，会导致线粒体膜电位降低，MPTP开放，ATP合成减少，导致细胞死亡。而细胞内钙过量可以进一步通过产生各种氧自由基、NO和其毒性产物一过氧亚硝基阴离子(ONOO－)的方式，过度活化蛋白激酶C(PKC)，Ca^2＋／Ca调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ、磷酸磷脂酶、蛋白质酶、蛋白磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、核酸内切酶及一氧化氮合成酶等造成糖原、磷脂、DNA、蛋白质等生物大分子降解，损伤细胞线粒体功能，加重细胞酸中毒，最终导致细胞凋亡。

4　结论

研究结果显示，经过急性力竭运动后，大鼠的肝细胞都不同程度地出现了凋亡情况，其中以中等强度力竭运动导致肝细胞凋亡最为显著。与此相应的，肝细胞线粒体ca2‘含量显著增加，这提示线粒体内Cs2’的大量积聚可能激活了细胞凋亡的启动程序，这使得中等强度运动更易于导致肝细胞凋亡。

参考文献：

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