酸碱耐受低温碱性脂肪酶产酶条件优化及其酶学性质
摘 要：以沙雷氏菌JXJ-7为供试菌株，采用单因素试验确定了其最适发酵培养基配方、最佳胞外产酶条件，并对其粗酶酶学性质进行了研究。结果表明：该菌株的最佳发酵培养基为葡萄糖3.750 g/L、牛肉浸膏8.75 g/L、K2HPO4 2 g/L、菜籽油乳化液体积分数1.75%，初始pH值9;最佳发酵条件为培养温度30℃、装样量20 mL/250 mL、接种量1.0%、發酵时间28 h;沙雷氏菌JXJ-7所产胞外脂肪酶粗酶最适底物为对硝基苯酚辛酸脂，在10～35℃的温度范围内具有较高的酶活力，其中35℃时酶活力最高，但热稳定性较差;该酶具有良好的酸碱耐受性，pH 值为9.5～10.5时酶活力较高;酶样品受到供试金属离子的抑制，在供试有机溶剂中具有良好的耐受性，对供试表面活性剂有一定的耐受性。总之，JXJ-7脂肪酶为低温碱性脂肪酶，在低温碱性环境的工业领域中有一定的应用潜力。
关键词：沙雷氏菌属;培养基;发酵条件;酶学性质;低温碱性脂肪酶
中图分类号：TQ920.6文献标识码：A文章编号：1006-060X（2018）11-0001-06
Optimization of Enzyme Production Conditions and Enzymatic Properties of Low Temperature Alkaline Lipase with Acid-base Tolerance
CHEN Fang，SHI Hong-qiu，ZHA Dai-ming，YU Tian-tian，ZHANG Bing-huo，LI Han-quan
（School of Pharmacy and Life Sciences， Jiujiang University， Jiujiang 332000， PRC）
Abstract： Using Serratia JXJ-7 as the test strain， the optimum fermentation medium formulation and the optimum conditions for extracellular enzyme production were determined by single factor test， and the crude enzymatic properties of Serratia JXJ-7 were studied. The results showed that the optimum fermentation medium was glucose 3.750 g/L， beef extract 8.75 g/L， K2HPO4 2 g/L， and rapeseed oil emulsion 1.75% at an initial pH 9. The optimum fermentation conditions were incubation temperature 30 ℃， sample loading 20 mL/250 mL，
inoculum concentration 1.0% and fermentation time 28 hours. Serratia JXJ-7 produced crude extracellular lipase and the optimum substrate was p-nitrophenol octanoic acid lipid. The enzyme activity was higher in the temperature range of 10 to 35 ℃， and the highest was at 35 ℃，
but the thermal stability was poor. It had good acid-base tolerance and high enzyme activity when pH value was 9.5-10.5. Enzyme samples were inhibited by metal ions， well tolerated in organic solvents， and a certain tolerance to the tested surfactants. In conclusion， JXJ-7 lipase is a low-temperature alkaline lipase， which has a certain application potential in the industrial field of low-temperature alkaline environment.
Key words： Serratia; culture medium; fermentation conditions; enzymatic properties; low temperature alkaline lipase
脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）又称三酰基甘油酰基水解酶（triacylglycerol acylhydrolases），属于α/β折叠酶家族，是一类能够催化天然油脂分解成脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯，并能在有机相中催化转酯、酯化、醇解等多种反应的酯键水解酶。从其定义可知，有机溶剂耐受性是脂肪酶广泛应用的必备特性[1-2]。
一般来说，脂肪酶在有机相中进行催化反应具有诸多优点：酶的活性更高、稳定性更好、选择性更强，底物的溶解性更好，产物的回收更容易，底物/产物对酶的抑制程度更低，反应平衡更倾向于合成方向等[3]。因此，脂肪酶在基于有机相催化的应用领域（如食品、精细化工、医药、生物能源等）具有较大
潜力[4-5]。
低温碱性脂肪酶在温度10～35℃、pH值8.0～10.5的范围内具有较高的催化活力，较好的有机溶剂耐受性，较差的热稳定性，因此在低温碱性环境的工业领域（如洗涤剂、食品加工、毛纺加工、生物制药、低温环境修复等）应用广泛。目前，低温碱性脂肪酶最大的应用领域是洗涤剂行业，其主要功能是清除衣物、碗碟、医疗器械上的油污以及疏通因油脂凝固而堵塞的下水管道[6]。自从第一个有机溶剂耐受脂肪酶被鉴定以来，越来越多的有机溶剂耐受脂肪酶被人们发现，它们主要来源于假单胞菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）[7]。然而，关于沙雷氏菌属（Serratia）脂肪酶具有有机溶剂耐受性的研究报道较少，到目前为止只有少数几个沙雷氏菌属脂肪酶表现出有机溶剂耐受性[8-13]。笔者以实验室分离并保藏的沙雷氏菌JXJ-7为研究对象，采用单因素分析法优化其胞外脂肪
酶的产酶条件，并对粗酶的酶学性质进行研究，旨在为
该菌株所产胞外脂肪酶的进一步应用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 沙雷氏菌JXJ-7，由实验室前期分离并保藏。
1.1.2 培养基 （1）LB液体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，自然pH值;固体培养基另加琼脂条18 g/L。（2）基础发酵培养基：麦芽糖5 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、大豆油乳化液体积分数2%，pH值7.0。（3）大豆油乳化液：大豆油与2%聚乙烯醇按1︰3的比例混合，10 000 r/min乳化10 min即可。
1.2 试验方法
1.2.1 JXJ-7脂肪酶活力的测定 挑取LB固体培养基上的沙雷氏菌JXJ-7单菌落，接种于4 mL LB液体培养基中，28℃、180 r/min培养20 h;然后以2%的接种量接种于20 mL基础发酵培养基中，28℃、180 r/min发酵24 h;取发酵液于4℃、4 500 r/min离心15 min，上清液即为胞外脂肪酶粗酶，酶活力的测定根据谢玉婷等[3]的方法进行。
1.2.2 沙雷氏菌JXJ-7发酵培养基的单因素优化 （1）碳源。在基础发酵培养基的基础上，以等量的葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉替代麦芽糖，按照1.2.1中的条件进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳碳源，对照组为无碳源组，其酶活力设为100%;分别添加1.250、1.875、2.500、3.125、3.750、4.375、5.000、5.625 g/L最佳碳源以确定其最适添加量，最适添加量组的酶活力设为100%。（2）氮源。在确定了最佳碳源及其添加量的基础上，以等量的硝酸钠、尿素、酵母提取物、牛肉浸膏替代基础发酵培养基中的蛋白胨，按照1.2.1中的条件进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳氮源，对照组为无氮源组，其酶活力设为100%;分别添加7.50、8.75、10.00、11.25、12.50 g/L最佳氮源以确定其最适添加量，最适添加量组的酶活力设为100%。（3）诱导剂。在确定了最佳碳源、氮源及其添加量的基础上，以等量的芝麻油乳化液、葵花籽油乳化液、玉米油乳化液、花生油乳化液、菜籽油乳化液替代基礎发酵培养基中的大豆油乳化液作为诱导剂，按照1.2.1中的条件进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳诱导剂，对照组为无诱导剂组，其酶活力设为100%;分别添加1.50%、1.75%、2.00%、2.25%、2.50%、2.75%、3.00%的最佳诱导剂以确定其最适添加量，最适添加量组的酶活力设为100%。（4）金属离子。在确定了最佳碳源、氮源、诱导剂及其添加量的基础上，以等量的CuSO4、CaSO4、FeSO4、MnSO4替代基础发酵培养基中的MgSO4，按照1.2.1中的条件进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳金属离子，对照组为无金属离子组，其酶活力设为100%。（5）初始pH值。在确定了最佳碳源、氮源、诱导剂、无机盐及其添加量的基础上，分别将发酵培养基的初始pH值调整为4、5、6、7、8、9、10、11，按照1.2.1中的条件进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳初始pH值，最佳组的酶活力设为100%。
1.2.3 沙雷氏菌JXJ-7发酵条件的的单因素优化 （1）发酵温度。采用优化后的发酵培养基，在初始发酵条件的基础上，分别在15、20、25、30、35℃下进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳发酵温度，最佳组的酶活力设为100%。（2）装样量。采用优化后的发酵培养基，在上一步发酵条件优化的基础上，分别以10、20、30、40 mL/250 mL装样量进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳装样量，最佳组的酶活力设为100%。（3）接种量。采用优化后的发酵培养基，在上一步发酵条件优化的基础上，分别以0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的接种量进行发酵培养，测定脂肪酶活力以确定最佳接种量，最佳组的酶活力设为100%。（4）发酵时间。采用优化后的发酵培养基，在上一步发酵条件优化的基础上进行发酵培养，分别在4、8、12、16、20、24、28、32、36 h取样测定脂肪酶活力以确定最佳发酵时间，最佳组的酶活力设为100%。
1.2.4 JXJ-7脂肪酶的酶学性质研究 （1）底物对粗酶酶活的影响。以对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚葵酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯、对硝基苯酚豆蔻酸酯和对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，分别测定脂肪酶活力以确定最适底物，最高酶活力设为100%。（2）温度对粗酶酶活的影响。在最适底物条件下，测定不同反应温度（15、20、25、30、35、40、45℃）下的脂肪酶活力，最高酶活力设为100%。在不同温度（30、40、50、60℃）下温浴处理酶样品，1 h后分别测定脂肪酶活力以确定温度稳定性，处理前的酶活力设为100%。（3）pH值对粗酶酶活的影响。在最适底物、最适温度条件下，添加Na2HPO4-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0）和Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH值分别为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5），分别测定脂肪酶活力，最高酶活力设为100%。在不同pH值缓冲液中28℃摇床处理酶样品，1 h后分别测定脂肪酶活力以确定pH值的稳定性，pH 值为7.0时酶活力设为100%。（4）金属离子和EDTA对粗酶酶活的影响。在上述优化后的反应体系中，分别加入Na2SO4、K2SO4、CaSO4、MgSO4、MnSO4、CuSO4、ZnSO4、Fe2（SO4）3和EDTA溶液，使终浓度为10 mmol/L，以添加等量双蒸水的酶样品为对照组，28℃摇床处理1 h后，分别测定脂肪酶活力以确定金属离子和EDTA对酶活力的影响，对照组的酶活力设为100%。（5）有机溶剂对粗酶酶活的影响。在上述优化后的反应体系中，分别加入异丙醇、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷，使体积分数分别为10%、30%、50%，以添加等量双蒸水的酶样品为对照组，28℃摇床处理1 h后，分别测定脂肪酶活力以确定有机溶剂对酶活力的影响，对照组的酶活力设为100%。（6）表面活性剂对粗酶酶活的影响。在上述优化后的反应体系中，分别加入阴离子型表面活性剂SDS、阳离子型表面活性剂CTAB和非离子型表面活性剂Triton X-100溶液，使终浓度分别为0.05%、0.10%，以添加等量双蒸水的酶样品为对照组，28℃摇床处理1 h后，测定脂肪酶活力以确定表面活性剂对酶活力的影响，对照组的酶活力设为100%。
1.2.5 数据处理 试验数据为3次独立重复试验的平均数，以平均数±标准差的形式表示。
2 结果与分析
2.1 沙雷氏菌JXJ-7的最适发酵培养基
2.1.1 碳 源 由图1A可知，供试碳源均对菌株JXJ-7产胞外脂肪酶具有显著性促进作用，其中葡萄糖的促进作用最强，其次依次为麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉和乳糖，因此研究选择葡萄糖作为最佳碳源。由图1B可知，葡萄糖添加量为5.000 g/L时，菌株产酶活力最强，由于3.750～5.000 g/L间的酶活力没有显著性差异，因此从经济角度选择3.750 g/L作为葡萄糖的最适添加量。
2.1.2 氮 源 由图2A可知，供试氮源均对菌株JXJ-7产胞外脂肪酶具有显著性促进作用，其中牛肉浸膏的促进作用最强，其次依次为酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠和尿素，因此研究选择牛肉浸膏作为最佳氮源。由图2B可知，牛肉浸膏添加量为11.25 g/L时，菌株产酶活力最强，由于8.75～11.25 g/L间的酶活力没有显著性差异，因此从经济角度选择8.75 g/L作为牛肉浸膏的最适添加量。
2.1.3 诱导剂 由图3A可知，菌株JXJ-7产胞外脂肪酶对供试诱导剂具有不同的响应，其中菜籽油、大豆油和葵花籽油乳化液作为诱导剂对该菌株产酶具有促进作用，而花生油、玉米油和芝麻油乳化液具有抑制作用，因此研究选择菜籽油乳化液作为最佳诱导剂。由图3B可知，菜籽油乳化液添加量为1.75%时，菌株产酶活力最强，因此选择1.75%为菜籽油乳化液的最适添加量。
2.1.4 金属离子 由图4可知，供试金属离子均对菌株JXJ-7产胞外脂肪酶具有顯著性抑制作用，因此发酵培养基中无需额外添加金属离子。
2.1.5 pH值 由图5可知，发酵培养基的初始pH值为5.0～11.0时，菌株JXJ-7具有较高的产胞外脂肪酶
图4 金属离子对菌株JXJ-7产脂肪酶的影响
活力，其中初始pH值为9时菌株产酶活力最高，因此研究选择9作最佳初始pH值。
2.2 沙雷氏菌JXJ-7的最佳发酵条件
2.2.1 发酵温度 由图6A可知，发酵温度对菌株JXJ-7产胞外脂肪酶的影响较大，15～25℃时菌株产酶活力缓慢上升，25～30℃时急剧上升并达到最高，随
后逐渐下降，因此研究选择30℃作为最佳发酵温度。
2.2.2 装样量 由图6B可知，装样量对菌株JXJ-7产胞外脂肪酶的影响不大，装样量为20 mL/250 mL时菌株产酶活力最高，因此研究选择20 mL/250 mL作为最佳装样量。
2.2.3 接种量 由图6C可知，接种量对菌株JXJ-7产胞外脂肪酶的影响不大，接种量为1.0%时菌株产酶活力最高，随后缓慢下降，因此研究选择1.0%作为最佳接种量。
2.2.4 发酵时间 由图6D可知，发酵时间是影响菌株JXJ-7产胞外脂肪酶的主要因素，随着发酵时间的延长菌株产酶活力缓慢上升，16 h后开始迅速上升，28 h达到产酶的峰值，随后逐渐下降，因此研究选择28 h作为最佳发酵时间。
2.3 JXJ-7脂肪酶的酶学性质
2.3.1 底物特异性 由图7可知，JXJ-7脂肪酶的最适底物为对硝基苯酚辛酸酯，其次依次为对硝基苯酚葵酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯、对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚豆蔻酸酯和对硝基苯酚棕榈酸酯，与其他沙雷氏菌属脂肪酶的底物特异性存在较大的差异[8，12，14]。
2.3.2 温度对酶活力及其稳定性的影响 由图8A可知，JXJ-7脂肪酶在15～45℃下的酶活力较高，均保持在68%以上，其中35℃下的酶活力最高，故35℃为该酶的最适反应温度。由图8B可知，酶样品的温度稳定性较差，在30～60℃范围内，随着温度的升高，温浴1 h后其残余酶活力急剧下降，其中30℃的残余酶活力只有温浴处理前的46.9%。研究表明，低温脂肪酶在10～35℃的温度范围内具有较高的酶活力以及较差的热稳定性[6]。因此，初步鉴定JXJ-7脂肪酶属于低温脂肪酶，具有较宽的反应温度和较差的温度稳定性，适合于低温环境下的催化反应。
2.3.3 pH值对酶活力的影响 由图9A可知，JXJ-7脂肪酶在pH值8.0～10.5下的酶活力较高，均保持在83%以上，其中pH值9.5～10.5范围内的酶活力最高，故9.5～10.5为该酶的最适反应pH值范围，但是在pH值低于8.0时其酶活力较低。由图9B可知，酶样品具有良好的pH值稳定性，在pH值5.0～10.5范围内，28℃处理1 h后，其残余酶活力均保持在93%以上，且在pH值 8.0～10.5范围内处于激活状态。可见，JXJ-7脂肪酶为低温碱性脂肪酶，具有较宽的最适反应pH值和良好的酸碱耐受性，在低温碱性环境的工业领域有着较大应用潜力。
2.3.4 金属离子和EDTA对酶活力的影响 由图10可知，JXJ-7脂肪酶受到所有供试金属离子和EDTA的抑制，其中Mg2+和EDTA的抑制作用没有显著性。由EDTA对酶活力没有显著性影响可知，JXJ-7脂肪酶为非金属酶，其催化的反应不需要金属离子参与。一般来说，Ca2+和Mn2+对脂肪酶活力具有激活作用，但是它们却抑制了JXJ-7脂肪酶的活力。这一特性与LipA脂肪酶和RB06-22脂肪酶相反[9，11]，与Lip42脂肪酶、UD-8脂肪酶和CICC1368脂肪酶类似[15-17]。
图10 金属离子和EDTA对JXJ-7脂肪酶粗酶活力的影响
2.3.5 有机溶剂对酶活力的影响 由表1可知，不同有机溶剂对JXJ-7脂肪酶活力有不同的影响，总体上与lgP值有关;当lgP<0时，除甲醇和乙醇外，酶活力随着有机溶剂体积分数的增大而降低，酶样品在10%～50%异丙醇、10%～50%甲醇、10%～30%乙腈、10%～50%乙醇和10%～50%丙酮中具有良好的耐受性，残余酶活力均在70%以上;当lgP>0时，除10%三氯甲烷显著抑制酶活力外，10%～50%乙酸乙酯、30%～50%三氯甲烷和10%～50%正己烷均对酶活力没有显著性影响。可见，JXJ-7脂肪酶的有机溶剂耐受性良好，适合于非水相或微水相催化反应，这一现象在其他沙雷氏菌属脂肪酶中也有报道[8-13]。
2.3.6 表面活性剂对酶活力的影响 由表2可知，不同离子类型的供试表面活性剂对JXJ-7脂肪酶活力有不同的影响。阴离子型表面活性剂SDS在体积分数为0.05%和0.10%时均强烈抑制JXJ-7脂肪酶的酶活力;而在0.05%和0.10%的阳离子型表面活性剂CTAB中JXJ-7脂肪酶表现出一定的耐受性，残余酶活力分别为91.7%和46.2%;对于非离子型表面活性剂Triton X-100，当其体积分数为0.05%时显著抑制酶活力，残余酶活力为88.2%，当其体积分数为0.10%时显著促进酶活力，残余酶活力为112.2%。可见，JXJ-7脂肪酶具有一定的表面活性剂耐受性，可在洗涤剂配方中应用。这一现象在其他沙雷氏菌属脂肪酶中也有报道[11，13]。
3 结 论
通过单因素分析，确定了沙雷氏菌JXJ-7高效产胞外脂肪酶的产酶条件，最佳发酵培养基为葡萄糖3.750 g/L、牛肉浸膏8.75 g/L、K2HPO4 2 g/L、菜籽油乳化液体积分数1.75%，初始pH值9;最佳发酵条件为装样量20 mL/250 mL、接种量1.0%、发酵温度30℃、发酵时间28 h。总之，该菌株能够利用葡萄糖、菜籽油等廉价易得的培养基原料，在较适宜的发酵条件下达到较高效的产胞外脂肪酶效果。
沙雷氏菌JXJ-7所产胞外脂肪酶粗酶的最适底物为对硝基苯酚辛酸脂，在10～35℃的温度范围内具有较高的酶活力，其中35℃时酶活力最高，但热稳定性较差;pH 值为9.5～10.5时酶活力较高，具有良好的酸碱耐受性;Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+显著性抑制酶活力，而Mg2+和EDTA对酶活力没有显著性影响;酶样品在异丙醇、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和正己烷中具有良好的耐受性;酶样品对阴离子表面活性剂SDS的耐受性很差，而对阳离子表面活性剂CTAB和非离子表面活性剂Triton X-100有一定的耐受性。总之，JXJ-7脂肪酶为低温碱性脂肪酶，在低溫环境中有较高的酶活力，具有良好的酸碱耐受性、有机溶剂耐受性和一定的表面活性剂耐受性，在低温碱性环境的工业领域中有一定的应用潜力，如食品加工、油脂加工、洗涤剂、低温环境修复等。
参考文献：
[1] Peng R，Lin J，Wei D Z. Purification and characterization of an organic solvent-tolerant lipase from Pseudomonas aeruginosa CS-2[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162（3）：733-743.
[2] 司冠儒. 粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达和发酵优化[D]. 无锡：江南大学，2013.
[3] 谢玉婷，查代明，石红璆，等. Burkholderia sp. JXJ-16低温耐有机溶剂脂肪酶产酶条件优化及粗酶酶学性质[J]. 食品工业科技，2017，38（4）：207-213.
[4] Sharma R，Chisti Y，Banerjee U C. Production，purification，characterization，and applications of lipases[J]. Biotechnology Advances，2001，19（8）：627-662.
[5] 查代明. 防御假单胞菌Pf-5脂肪酶LipA的分子鉴定、酶学性质及基因表达调控研究[D]. 武汉：华中科技大学，2014.
[6] 刘瑞娟，王海宽，路福平，等. 低温碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶培养基的优化[J]. 天津科技大学学报，2009，24（1）：6-10.
[7] Kim J，Jang S H，Lee C. An organic solvent-tolerant alkaline lipase from cold-adapted Pseudomonas mandelii：cloning，expression，and characterization[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2013，77（2）：320-323.
[8] Zhao L L，Xu J H，Zhao J，et al. Biochemical properties and potential applications of an organic solvent-tolerant lipase isolated from Serratia marcescens ECU1010[J]. Process Biochemistry，2008，43（6）：626-633.
[9] 朱绮霞，陈 英，张 搏，等. 粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆表达和酶学性质的研究[J]. 生物技术，2010，20（5）：12-16.
[10] 司冠儒. 粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达和发酵优化[D]. 无锡：江南大学，2013.
[11] Ugur A，Boran R. Production and characterization of a cold-active and n-hexane activated lipase from a newly isolated Serratia grimesii RB06-22[J]. Biocatalysis and Biotransformation，2014，32（4）：222-230.
[12] 李婧玒，李仁宽，林 娟，等. 粘质沙雷氏菌低温脂肪酶的基因克隆与酶学性质分析[J]. 福州大学学报（自然科学版），2016，44（5）：738-745.
[13] García-Silvera E E，Martínez-Morales F，Bertrand B，et al. Production and application of a thermostable lipase from Serratia marcescens in detergent formulation and biodiesel production[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2018，65（2）：156-172.
[14] Yao H Y，Yu S W，Zhang L D，et al. Isolation of a novel lipase gene from Serratia liquefaciens S33 DB-1，functional expression in Pichia pastoris and its properties[J]. Molecular Biotechnology，2008，38（2）：99-107.
[15] 张银波. 脂肪酶基因的克隆与表达研究[D]. 北京：中国农业科学院，2009.
[16] 王 刚. 耐有机溶剂脂肪酶高活性菌株选育、酶合成及酶学特性研究[D]. 长春：吉林农业大学，2011.
[17] 王 迪. 发酵性丝孢酵母脂肪酶与蛋白酶发酵及性质的比较[D]. 大连：大连工业大学，2012.
（责任编辑：成 平）